基礎生物化學-酶

1、,3 酶（Enzyme）3.1 酶是生物催化劑3.2 酶的命名與分類3.3 酶的作用機理3.4 酶促反應動力學3.5 酶活性調(diào)節(jié)3.6 酶活力測定及分離提純3.7 維生素和輔酶,3.1 酶是生物催化劑3.1.1 酶的概念酶（enzyme）:是由活細胞產(chǎn)生的具有高度專一性和催化功能的蛋白質，由于它催化生物體內(nèi)的一切化學反應，故稱之為生物催化劑(biological catalyst) 。ribozyme（核酶）：具催化

2、能力的RNA分子。,新陳代謝是生物體的重要特征，生物體內(nèi)不斷地進行著各種化學反應，由于酶的存在使這些反應變得容易和迅速；酶降低了化學反應的活化能(activation energy) ，使生物體具有穩(wěn)定而溫和的內(nèi)部條件下，迅速地進行著各種復雜的反應；酶通過在機體內(nèi)的分布、含量、活性等方面的控制，調(diào)節(jié)著體內(nèi)的有序代謝過程。,3.1.2 酶催化作用的特點 酶與一般催化劑一樣，只能催化熱力學允許的化學反應;縮短達到化學平衡的時間，而不

3、改變平衡點;酶作為催化劑在化學反應的前后沒有質和量的改變;微量的酶就能發(fā)揮較大的催化作用。E + S ＝ES ? E + P,酶和一般催化劑的作用機理都是降低反應的活化能。加快反應的速度，不能改變反應的平衡點。,由于酶的化學本質是蛋白質，因此酶促反應又具有其特性。3.1.2.1 催化效率高酶能大幅度降低反應的活化能，較化學催化劑活性高107~1013倍。化學反應：活化能： 無催化劑 18000c

4、al/mol 膠態(tài)鈀（鉑） 11700cal/mol 過氧化氫酶 1700cal/mol,3.1.2.2 酶的高度專一性(specificity) 酶對底物及催化的反應都有嚴格的選擇性，一種酶只能催化一類甚至一種化學反應，并生成一定的產(chǎn)物，這種現(xiàn)象稱為酶的專一性。受酶催化的化合物稱為該酶的底物或作用物(substrate)。如

5、酯酶只能水解酯類。,酶對底物的專一性分為結構專一性和立體異構專一性。⑴結構專一性根據(jù)酶對底物結構的要求不同，分為相對專一性和絕對專一性。①絕對專一性(absolute specificity) ：這些酶對底物有非常嚴格的要求，只作用一種底物，而不作用其它任何物質。如脲酶(urease)只作用于尿素而不作用于其衍生物 (如尿素的甲基取代物或氯取代物) 。,②相對專一性(relative specificity) ：酶對底物要求較低，

6、作用的底物不至一種，對作用底物鍵的兩端的要求程度不同又可分為基團專一性和鍵專一性。a、鍵專一性：酶對鍵的兩端無嚴格要求，只要求一定的鍵。如：酯酶(lipase)、二肽酶等。,b、基團專一性：又稱為族專一性，酶不但要求底物一定的化學鍵，而且對鍵一端的基團也有嚴格要求。如：?-D-葡萄糖苷酶不但要求? -糖苷鍵，并要求鍵的一端必須有葡萄糖殘基，而對另一端基團無嚴格要求，可水解蔗糖和麥芽糖。,⑵立體異構專一性(stereospecifici

7、ty)幾乎所有的酶對于立體異構體都具有高度的專一性。酶對底物的立體構型的特異要求，可分為旋光異構專一性和幾何異構專一性a、旋光異構專一性：當?shù)孜镉行猱悩嬻w時，酶只作用其中的一種。如L-AA氧化酶只作用于L-AA、L-乳酸脫氫酶的底物只能是L型乳酸，而不能是D型乳酸。,例如乳酸脫氫酶是具有立體異構特異性的酶，它能催化乳酸脫氫生成丙酮酸的可逆反應。,L(+)乳酸通過其不對稱C原子上的CH3、COOH及OH基分別與乳酸脫氫酶活性中心的A

8、、B及C三個功能基團結合，故可受酶催化而轉變?yōu)楸帷６鳧(-)乳酸由于OH、COOH的空間位置與L(+)乳酸相反，與酶的三個結合基團不能完全配合，故不能與酶結合受其催化。,乳酸脫氫酶的立體異構特異性A、B、C分別為LDH活性中心的三個功能基團。,因此，酶的特異性不但決定于酶活性中心的功能基團的性質，而且還決定于底物和活性中心的空間構象，只有那些有一定的化學結構，能與酶的結合基團結合，而且空間構型又完全適應的化合物，才能作為酶的底物

9、。,b、幾何異構專一性：如延胡索酸水化酶只催化延胡索酸即反-丁烯二酸水合生成蘋果酸及其逆反應，而不催化順-丁烯二酸。 HOOCHC 延胡索酸水化酶 CH2COOH + H2O CHCOOH

10、 CHOHCOOH 延胡索酸 蘋果酸酶的專一性取決于酶的活性中心的構象及性質。酶與底物的結合，至少存在三個結合點。,,,,,,,3.1.2.3 酶易失活 酶是蛋白質，酶促反應要求一定的pH、溫度等溫和的條件，凡是能使蛋白質變性的因素都可使酶失活；強酸、強堿、有機溶劑、重金屬鹽、高

11、溫、紫外線、劇烈震蕩等任何使蛋白質變性的理化因素都可能使酶變性而失去其催化活性。 同時溫度、pH值等也影響酶的活性。,3.1.2.4 酶活力受多種因素的調(diào)節(jié)和控制 酶是生物體的組成成份，和體內(nèi)其他物質一樣，不斷在體內(nèi)新陳代謝，酶活力的調(diào)控方式很多，包括酶的生物合成的誘導和阻遏，抑制劑調(diào)控、共價修飾調(diào)控、反饋調(diào)控、酶原激活及激素調(diào)控等。這些調(diào)控保證酶在體內(nèi)新陳代謝中發(fā)揮其適當?shù)拇呋饔?，使生命活動中的種種化學反應都能夠有條不紊、協(xié)

12、調(diào)一致地進行。,3.1.2.5 酶的催化活性與輔因子有關有些酶是復合蛋白，由酶蛋白和非蛋白小分子物質——輔助因子組成，只有二者結合酶才有活性。,3.1.3 酶的化學本質3.1.3.1 酶是蛋白質幾乎所有的酶都是蛋白質，有的是簡單蛋白質，有的是結合蛋白質，具有蛋白質的一切性質。,3.1.3.2 酶的組成分類根據(jù)酶的組成成份，可分單純酶和結合酶兩類。單成分酶（單純酶，simple enzyme）：是基本組成單位僅為氨基酸的一類酶

13、不含其他成分，它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質結構。如脲酶，蛋白酶，脂肪酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等水解酶。,雙成分酶（結合酶，conjugated enzyme ）：這類酶分子中除了蛋白質部分（酶蛋白，apoenzyme ）外還有非蛋白質成分（輔因子，cofactors ），兩者結合成的復合物稱作全酶(holoenzyme) 。全酶=酶蛋白+輔因子（輔酶、輔基）,輔因子包括輔酶、輔基和金屬離子，金屬離子作為酶活性的組成部分；或者是

14、連接底物和酶分子的橋梁；或在穩(wěn)定酶蛋白分子構象方面所必需。輔酶和輔基是一類小分子化合物，它們的主要作用是在反應中傳遞電子、質子或一些基團。①輔酶（co-enzyme）輔酶與酶蛋白結合較疏松（非共價鍵相連），可以用透析或超濾方法除去，一種輔酶可為幾種酶的輔酶。,②輔基（prosthetic group）輔基與酶蛋白結合緊密（共價鍵相連），不易用透析或超濾方法除去，需經(jīng)化學處理才能將其與酶蛋白分開，輔基一般為一種酶專有 。輔酶和輔基

15、的差別僅僅是它們與酶蛋白結合的牢固程度不同，而無嚴格的界限。,3.1.3.3單體酶、寡聚酶和多酶復合體根據(jù)酶蛋白分子結構上的特點可分為單體酶、寡聚酶和多酶復合體。①單體酶(monomeric enzyme )單體酶只有一條多肽鏈，這一類酶很少，一般為水解酶類，相對分子質量為13000～35000。,②寡聚酶(oligomeric enzyme)寡聚酶由幾個甚至幾十個亞基組成，亞基相同或不同，亞基間以非共價鍵結合，用4 mol／L

16、尿素溶液或其它方法可以把它們彼此分開。 寡聚酶的相對分子質量從35 000到幾百萬。例如磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脫氫酶等。,③多酶體系(multienzyme system)多酶復合體是由幾個酶聚合(嵌合)而成的復合體。一般由在系列反應中2~6個功能相關的酶組成，它有利于一系列反應的連續(xù)進行，以提高酶的催化效率，同時便于機體對酶的調(diào)控。多酶復合體相對分子質量都很高，一般都在幾百萬以上。例如丙酮酸脫氫酶復合體（總相對分子質量達46

17、0 000）和脂肪酸合成酶復合體。,3.1.3.4 核酶 核酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應。 Ribozyme的發(fā)現(xiàn)突破了酶的化學本質都是蛋白質的這一傳統(tǒng)觀念。,,3.2 酶的命名與分類酶學研究飛速發(fā)展，新酶不斷被發(fā)現(xiàn)，為了避免混亂，必須進行統(tǒng)一地分類和命名。 3.2.1 酶的分類國際酶學委員會(I.E.C)規(guī)定，將所有的酶按催化反應的性質分為6大類，分別用

18、1、2、3、4、5、6編號表示。再根據(jù)底物中被作用的基團或鍵的特點將每一大類分為若干亞類，并按順序編成1、2、3??等數(shù)字；每一亞類再分成若干亞亞類，仍用1、2、3編號，這樣每一個酶的分類號由四個數(shù)字組成，數(shù)字間用“.”分開。,如：乙醇脫氫酶， 編號為：EC.1.1.1.1； 乳酸脫氫酶， 編號為：EC.1.1.1.27； 檸檬酸裂合酶， 編號為：EC.4.1.1.1,3.2.1.1 氧化還原酶類 （oxide

19、-reductases）催化氧化還原反應，涉及H或e-的轉移。又可分為脫氫酶和氧化酶二類。① 脫氫酶：反應通式,②氧化酶：反應通式 2AH2+O2 =2A+ 2H2O,3.2.1.2 轉移酶類 （ transferases）催化底物之間進行某些基團的轉移或交換的酶類，如轉酮基、轉氨基、轉酰基等。 反應通式： A-X + B =A + B-X,3.2.1.3 水解酶類（hydrolase

20、s）催化底物分子加水分解成兩個分子。 反應通式：A-B + H2O == A-OH + B-H,3.2.1.4 裂合酶類（lyases）催化從底物分子上移去一個基團而留下雙鍵的反應和逆反應，或使底物斷裂成兩種分子的反應和逆反應，如醛縮酶、水化酶、脫氨酶等。反應通式：,3.2.1.5 異構酶類（isomerases）催化同分異構體間的相互轉變。如，磷酸丙糖異構酶、消旋酶等。 ①異構酶②表異構酶③變位酶

21、,3.2.1.6 合成酶類(synthatases，連結酶，ligases)在ATP(或GTP，UTP等)參與下，催化兩個分子合成另一分子的反應。反應通式：,天冬酰胺合成酶,3.2.2 酶的命名法3.2.2.1 普通命名法（習慣命名法）①根據(jù)酶催化的底物來命名 底物+酶如蔗糖酶，蛋白酶，淀粉酶、脂酶、核酸酶等。②根據(jù)酶作用的底物及反應的性質命名

22、 底物+反應類型+酶如琥珀酸脫氫酶，氨基酸氧化酶，異檸檬酸裂解酶等。,③有時注明酶的來源及特性如木瓜蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，胃蛋白酶，酸性磷酸酯酶。④催化反應的性質如水解酶、異構酶、裂解酶等。習慣命名法簡單，應用歷史長，但缺乏系統(tǒng)性，有時出現(xiàn)一酶數(shù)名或一名數(shù)酶的現(xiàn)象。,3.2.2.2 國際系統(tǒng)命名法鑒于新酶的不斷發(fā)現(xiàn)和過去文獻中對酶命名的混亂，國際酶學委員會規(guī)定了一套系統(tǒng)的命名法，使一種酶只有一種名稱。它包括酶的系統(tǒng)命名和

23、4個數(shù)字分類的酶編號?；驹瓌t：全部參與反應的底物（中間用：號分開）+酶催化反應的性質+酶,反應：系統(tǒng)命名：ATP：葡萄糖磷酸轉移酶。表示該酶催化從ATP中轉移一個磷酸到葡萄糖分子上的反應。它的分類數(shù)字是：E.C.2.7.1.1, E.C代表按國際酶學委員會規(guī)定的命名，第1個數(shù)字(2)代表酶的分類名稱(轉移酶類)，第2個 (7)代表亞類(磷酸轉移酶類)，第3個(1)代表亞亞類(以羥基作為受體的磷酸轉移酶類)，第4個(1)代表該酶

24、在亞亞類中的排號(D葡萄糖作為磷酸基的受體)。,系統(tǒng)名：乳酸：NAD+氧化還原酶，編號為：EC.1.1.1.27；習慣名：乳酸脫氫酶,3.3 酶的作用機理3.3.1 酶作用在于降低反應活化能化學反應中，反應物分子必須超過一定的能閾而成為活化的狀態(tài)，才能發(fā)生變化形成產(chǎn)物。1mol底物全部進入活化狀態(tài)所需要的自由能稱為活化能。,對反應體系加熱或照光，增加反應分子的自由能使反應分子活化；也可使用催化劑降低反應的能閾，使反應沿著一個

25、活化能較低的途徑進行。催化劑的作用，主要是降低反應所需的活化能，以致相同的能量能使更多的分子活化，從而加速反應的進行。酶能顯著地降低活化能，故能表現(xiàn)為高度的催化效率。,非催化過程和催化過程自由能的變化,3.3.2 中間產(chǎn)物學說酶能改變反應途徑而降低反應的活化能。中間產(chǎn)物學說認為：在酶促反應中，底物 (substrate, S)與酶結合成不穩(wěn)定中間產(chǎn)物后，再分解成酶與產(chǎn)物 (product, P) 。,由于形成ES的活化能及ES

26、分解為E+P的活化能均較低，所以總反應的活化能降低了。即ES的形成，改變了原來反應的途徑，降低了活化能，使反應加速。,證據(jù)由于ES的形成速度很快，且很不穩(wěn)定，一般不易得到ES復合物存在的直接證據(jù)。但從溶菌酶結構的研究中，已制成它與底物形成復合物的結晶，并得到了X線衍射圖，證明了ES復合物的存在。,過氧化物酶含有鐵卟啉，酶溶液呈紅褐色，在645、583、548、498nm處有特征吸收光譜。當向酶溶液中加入過氧化氫后，酶液變成紅色，只吸收

27、561、530.5nm的光，說明酶與底物之間發(fā)生了作用而形成新的物質。若此時再加入氫供體（如焦性沒食子酸），吸收光譜變回原來的四個條帶，酶液又變回紅褐色。,3.3.3 酶的分子結構和活性中心酶分子很大，其催化作用往往并不需要整個分子，如用氨肽酶處理木瓜蛋白酶，使其肽鏈自N端開始逐漸縮短，當其原有的180個氨基酸殘基被水解掉120個后，剩余的短肽仍有水解蛋白質的活性。表明酶的催化活性僅與酶的一小部分區(qū)域有關，這一區(qū)域就是酶的活性中心。,

28、酶的活性中心也稱活性部位（active site），是指酶分子中與底物結合并起催化反應的空間部位。酶分子中與酶活性有關的基團稱為酶的必需基團(essential group)。它是酶分子中表現(xiàn)催化活力所必需的部分，包括活性中心和活性中心以外的對維持活性中心空間構象所必需的一些基團。,有些必需基團雖然在一級結構上相距很遠，但在空間結構上彼此靠近，形成具有一定空間結構的區(qū)域，與底物結合并將底物轉化為產(chǎn)物，構成酶的活性中心。結合酶在空間結

29、構上幾個靠近的氨基酸殘基的一些側鏈基團（有時也包括主鏈上的集團）和輔因子一起構成酶的活性中心。,酶的活性中心由結合部位和催化部位所組成。結合部位（binding site）： 由有一定特性的基團組成，一定的底物靠此部位結合到酶分子上，此部位決定酶的專一性。催化部位（catalytic site）：由一些參與催化反應的基團組成，起催化作用，底物分子中的化學鍵在此部位被打斷或形成新鍵，從而發(fā)生一定的化學變化，此部位決定酶的催化高效性。,

30、外界理化因素可改變酶的活性，原因是它們可能首先影響了酶的活性中心的特定結構，包括必需基團形成的次級鍵的破壞。,Hydrophobic,Hydrophilic,Total,+ substrate,Backbone,Watson et al. (1987) Mol Biol Gene, Plate 3,溶菌酶（Lysozyme）,■二十種氨基酸的特征：,有大有小,有正有負,有極性非極性,,,3.3.4 誘導契合學說1

31、890年，Emil Fischer提出的鎖鑰結合學說解釋酶的高度專一性，但它不能解釋可逆反應中酶既適應與底物又適應與產(chǎn)物。1958年，D.E.Koshland Jr.提出了誘導契合學說，認為：酶活性部位的構象是柔韌可變的。酶同底物結合時，酶活性部位因受底物的誘導，會改變其構象使適合與底物契合而結合成中間絡合物，進行反應。當酶從ES復合物分離出來后，即恢復其原有構象。,3.3.5 酶的高效催化機制①趨近效應(approximatio

32、n)和定向效應(oientation)酶可使其底物結合在它的活性部位。底物分子在酶活性中心區(qū)域的有效濃度大大增高，從而加速反應。酶與底物特異性結合后，酶的構象發(fā)生變化，使其催化位點基團和結合位點基團正確地排列并定位，使參加反應的幾種底物基團定向于酶的催化部位。,底物分子和酶活性中心上的一個催化基團在相互作用時的趨近效應,②張力作用(distortion or strain)酶與底物結合時，酶的構象會發(fā)生變化，酶分子構象變化可對底

33、物產(chǎn)生張力，使底物分子中的敏感鍵產(chǎn)生張力或變形，使敏感鍵更易于破裂。,③ 酸堿催化作用（ acid-base catalyst）指廣義的酸堿催化，即質子供體和質子受體對酶促反應的催化作用，催化了細胞內(nèi)的許多種類的有機反應。酶活性中心的氨基、羧基、巰基和咪唑基等都可作為質子的供體或受體對底物進行催化。其中咪唑基的解離常數(shù)為6.0，在中性條件下可作為質子供體或質子受體，它常和其他活性氨基酸殘基如Asp、Ser等一起構成電荷轉接系統(tǒng)。,

34、④共價催化作用（covalent catalyst）又稱共價中間產(chǎn)物學說。酶和底物以共價鍵形成一個不穩(wěn)定的共價中間復合物，這些復合物比無酶存在時更容易進行化學反應，使反應加快。,⑤微環(huán)境效應(酶活性中心的低介電區(qū)效應)一般酶的活性中心穴內(nèi)是一個相對的非極性區(qū)，因此酶的催化基團被低介電環(huán)境包圍，底物分子的敏感鍵和酶的催化基團之間就會有很大的反應力，加速酶反應。,3.3.6 胰凝乳蛋白酶的催化機理胰凝乳蛋白酶的活性中心由Ser195、

35、His57和Asp102組成，它們構成一個電荷轉接系統(tǒng)， Ser195由于His57和Asp102的影響而成為很強的親核基團，易于供出電子。,Ser195的氧原子對底物敏感肽鍵的羰基碳原子進行親核攻擊，形成一個不穩(wěn)定的過渡態(tài)，同時一個質子從Ser195轉移到His57。,結果底物的敏感鍵斷裂，其中胺成分通過氫鍵與酶的His57咪唑基連接，底物的羧基部分酯化到Ser195的羥基上。,胺從中間物中釋放出來，電荷轉接系統(tǒng)從水中吸收一個質子，結

36、果OH-立即攻擊連在Ser195上的底物的羧基碳原子。,His57供出一個質子到Ser195的氧原子上，底物中的酸成分從Ser195上釋放出來，這時酶又恢復自由狀態(tài)。,3.3.7 酶原激活（zymogen activation）有些酶在其生物合成后即可自發(fā)地折疊成一定的構象，表現(xiàn)出全部活性，如溶菌酶；而有些酶在生物體內(nèi)先合成出來的是其無活性前體稱為酶原（zymogen），這些酶原必需在一定的條件下（某種酶或酸），被打斷一個或幾個特定的

37、肽鍵，從而使構象發(fā)生一定的變化后才表現(xiàn)出活性，這一過程稱為酶原激活。,如胰蛋白酶原的激活，腸激酶將其N端的一個6肽切去，即變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。胰蛋白酶原N端--Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ile-Val-Gly... C端 ?N端--Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys + Ile-Val-Gly... C端 6

38、肽 活性胰蛋白酶,在組織細胞中，某些酶以酶原的形式存在可保護分泌酶原的組織不被水解破壞；同時，酶原激活也是有機體調(diào)控酶活的一種方式。,3.4 酶促反應動力學酶促反應動力學(kinetics of enzyme-catalyzed reactions)是研究酶促反應速度及其影響因素的科學。影響酶促反應的主要因素包括酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等。在

39、研究某一因素對酶促反應速度的影響時，應該維持反應中其它因素不變，而只改變要研究的因素。,研究酶促反應動力學有助于闡明酶的結構與功能的關系，也可為酶作用機理的研究提供數(shù)據(jù)；有助于尋找最有利的反應條件，以最大限度地發(fā)揮酶催化反應的高效率；有助于了解酶在代謝中的作用或某些藥物作用的機理等。,3.4.1 酶促反應的速率酶促反應動力學中所指的速度是反應的初速度，因為此時反應速度與酶的濃度呈正比關系，這樣避免了反應產(chǎn)物以及其他因素的影響。酶促反

40、應的速率（?），一般是以單位時間內(nèi)底物被分解的量來表示（?mol/min、mg/min等）。通過測定單位時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量可以得到酶促反應速度。,酶促反應在開始的初期速率較大，隨后由于產(chǎn)物濃度的逐漸增加，反應速率漸漸下降，最后完全停止。因此測定酶的反應速率一般只測反應開始的初速，而不是測定反應達到平衡時所需的時間。,,,,,[P],t,斜率=[P]/t=v,3.4.2 酶濃度對反應速度的影響在一定的溫度和pH條件下，

41、當?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶的濃度時，酶的濃度與反應速度呈正比關系。 v= k[E],3.4.3 底物濃度對酶作用的影響和米氏方程3.4.3.1 底物濃度對反應速度的影響,在酶濃度不變的情況下，底物濃度對反應速度的影響呈雙曲線。,在底物濃度很低時，反應速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關系，表現(xiàn)為一級反應。隨著底物濃度的升高，反應速度不再呈正比例加快，反應速度增加的幅度不斷下降。如果繼續(xù)加大底物濃度，反應速度不再增加，表現(xiàn)為零級

42、反應。此時，無論底物濃度增加多大，反應速度也不再增加，說明酶已被底物所飽和。所有的酶都有飽和現(xiàn)象，只是達到飽和時所需底物濃度各不相同而已。,根據(jù)中間產(chǎn)物學說，在底物濃度較低時，只有一部分酶與底物形成中間絡合物ES，若此時增加[S]，[ES]增加，反應速度加快，當[S]很大時，體系中的酶分子都被底物所結合成ES，此時[S]再增加，但無剩余的E與之結合，反應速度不會增加。,3.4.3.2 米曼氏方程式(Michaelis-menten eq

43、uation)20世紀初觀察到酶被底物所飽和的現(xiàn)象。當[E]、T、pH 恒定時，在[S]很低的范圍內(nèi)，反應初速度(v)與[S]成正比： v = k[S]當?shù)孜餄舛冗_一定限度時， V=Vmax,v = k [S] 只表示反應初速與底物濃度的關系，不能代表整個反應中底物濃度與反應速率的關系。,1913年，Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學說，推導出了反應速度和底物濃度關系的數(shù)學方程式

44、，即米氏方程。,V：某一底物濃度時的反應速度Vmax：最大反應速度[S]：底物濃度Km：米氏常數(shù)（Michaelis constant）,當[S]很低時，[S]《Km，則V≌Vmax·[S] /Km，反應速度與底物濃度呈正比。當[S]很高時，[S]》Km，此時V≌Vmax，反應速度達最大速度，[S]再增高也不影響反應速度。,酶與不同濃度的底物相互作用模式,米氏方程式的推導米氏方程式提出后又經(jīng)Briggs和Haldan

45、e的充實和發(fā)展，米氏方程推導過程：,K1、K2、K3和K4分別為各向反應的速度常數(shù)。,(1).ES的生成途徑來自E+S和E+P，但其中E+P生成ES的速度極?。ㄓ绕湓谄鹗茧A段，P的生成很少），可以忽略不計，(2).又因為[S]》[E]，中間產(chǎn)物ES中的S濃度可以忽略不計。,因此，ES的生成速度為：,[Et]-[ES]為游離酶的濃度,ES的分解速度為：,(3).當反應體系處于穩(wěn)態(tài)時，ES生成和分解的速度相等。,即： K1([Et] －[

46、ES])·[S]=(K2+K3) ·[ES],則：,令,即,則,形成ES的反應較快，生成P的速度較慢，因此總反應速度取決于K3，故V=K3[ES]在酶促反應達最大速度時，所有的酶分子都已與底物結合形成中間產(chǎn)物，此時[Et]=[ES]那么：Vmax=K3[Et],在上式兩邊乘以K3得：,由于V=K3[ES]；Vmax=K3[Et]即：,3.4.3.3 米氏常數(shù)的意義和測定⑴米氏常數(shù)的意義①當v=

47、9;Vmax時，Km=[S]。Km值等于酶促反應速度為Vmax一半時的底物濃度（m mol/L） 。,② Km值可用來表示酶對底物的親和力因為Km=（K2+K3）／K1，當K2》K3，即ES解離成E和S的速度大大超過分離成E和P的速度時，K3可忽略不計，此時Km值近似于ES解離常數(shù)KS，此時Km值可用來表示酶對底物的親和力。Km=K2/K1=[E][S]/[ES]=KS,Km值愈大，酶與底物的親和力愈??；Km值愈小，酶與底物親和力

48、愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達到最大反應速度。但是K3值并非在所有酶促反應中都遠小于K2，所以Ks值（又稱酶促反應的底物常數(shù)）和Km值的涵義不同，不能互相代替使用。,③Km是酶的特征常數(shù)Km只與酶的性質，酶所催化的底物和酶促反應條件（如溫度、pH、有無抑制劑等）有關，與酶和底物的濃度無關。不同的酶Km值不同，因而可通過測定來鑒定不同的酶。Km不是ES的單獨解離常數(shù)，而是ES在參加反應中整個復雜化學平

49、衡的解離常數(shù)。,酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時，Km值也不同，其中Km值最小的底物稱為該酶的最適底物或天然底物。各種酶的Km值一般在10-3～10-5 m mol/L之間。,⑵ 米氏方程的應用可以根據(jù)所要求的速度，求出應加入底物的合理濃度，或根據(jù)底物濃度求反應速度，如：例1. 欲使 V=99%Vmax,其底物的濃度應為：,欲使 V=90%Vmax ,其底物的濃度應為：,例2. 過氧化氫酶的Km為25mmol

50、，底物的濃度為100mmol，求反應速度v。,答案：v=Vmax80%,⑶ Km和Vmax的求法底物濃度曲線是雙曲線。 從圖中很難精確地測出Km和Vmax。為此人們將米氏方程進行種種變換，將曲線作圖轉變成直線作圖。,①雙倒數(shù)作圖法將米氏方程兩邊取倒數(shù)，以1/V對1/[S] 作圖。,? 1/V=(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax 則橫、縱軸截矩為： -1/Km , 1/Vmax斜率：Km/Vmax

51、,②V對V/[S]作圖法以v為縱坐標對v/[S]橫坐標作圖，所得直線，其縱軸的截距為Vmax，斜率為Km。,將米氏方程經(jīng)移項整理后可寫成：V=-Km(V/[S])+Vmax , 斜率為-Km,米氏方程只適用于較簡單的酶作用過程，對于比較復雜的酶促反應過程，如多酶體系、多底物、多產(chǎn)物、多中間物等，還不能全面地籍此概括和說明，必須借助于復雜的計算過程。,3.4.4 pH對酶促反應速度的影響 酶反應介質的pH可影響酶分子，特別是

52、活性中心上必需基團的解離程度和催化基團中質子供體或質子受體所需的離子化狀態(tài)，也可影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶與底物的結合。,⑴ 酶的最適pH只有在特定的pH條件下，酶、底物和輔酶的解離情況才最適宜于它們互相結合，并發(fā)生催化作用，使酶促反應速度達最大值，此pH值稱為酶的最適pH(optimum pH)。它和酶的最穩(wěn)定pH不一定相同。溶液的pH值高于和低于最適pH時都會使酶的活性降低，遠離最適pH值時甚至導致酶的變性失活。測定酶

53、的活性時，應選用適宜的緩沖液，以保持酶活性的相對恒定。,胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲線,各種酶在一定的條件下都有其一定的最適pH，最適pH不是酶的特征性常數(shù)，它受底物濃度、緩沖液的種類和濃度以及酶的純度等因素的影響。 植物及微生物的酶，最適 pH 一般為4.5~ 6.5；動物體內(nèi)多數(shù)酶的最適pH值接近中性（6.5~8.0），但也有例外，如胃蛋白酶的最適pH約1.8，肝精氨酸酶最適pH約為9.8。,⑵pH影響酶活性的原因①

54、過酸過堿可使酶蛋白分子中維持空間結構的次級鍵破壞，酶變性失活。②pH的改變影響酶活性中心某些基團的解離狀態(tài)，以及底物的解離狀態(tài)，影響酶與底物的結合。,3.4.5 溫度對酶促反應速度的影響,,,溫度較低時，反應速度隨溫度升高而加快，溫度每升高10℃，溫度系數(shù)(Q10) 約增加1~2倍。但溫度超過一定數(shù)值后，酶受熱變性的因素占優(yōu)勢，反應速度隨溫度上升而下降，呈倒“U”形曲線。反應速度最大時的溫度，為酶的最適溫度(optimum tempe

55、rature)。,不同來源酶的最適溫度不同。從動物組織提取的酶，其最適溫度多在35℃～40℃之間，溫度升高到60℃以上時，大多數(shù)酶開始變性，80℃以上，多數(shù)酶的變性不可逆。但Taq DNA聚合酶的最適溫度為70 ℃ 。酶的活性雖然隨溫度的下降而降低，但低溫一般不破壞酶。溫度回升后，酶又恢復活性。臨床上低溫麻醉就是利用酶的這一性質以減慢組織細胞代謝速度，提高機體對氧和營養(yǎng)物質缺乏的耐受力，有利于進行手術治療。,酶的最適溫度不是酶的特征性

56、常數(shù)。酶的表觀最適溫度與酶的作用時間、緩沖劑、pH及底物有關。酶可以在短時間內(nèi)耐受較高的溫度，相反，延長反應時間，最適溫度便降低。溫度對酶促反應速度的影響主要是在于影響了分子活度、酶蛋白穩(wěn)定性以及ES的形成和解離。,3.4.6 激活劑對酶促反應速度的影響能提高酶活性的物質稱為激活劑(activator)。激活劑大部分是離子或簡單的有機化合物。如Mg2+是多種激酶和合成酶的激活劑，動物唾液中的α-淀粉酶則受Cl-的激活。,按激活劑分

57、子大小分為三類①無機離子K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、CI-、Br-等可作為酶的輔助因子的成分，或作為酶的激活劑。具有一定的選擇性或拮抗作用；激活作用與離子濃度有關。②小分子有機物如半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、巰基乙醇等還原劑（酶分子中-S—S-還原為-SH)以及金屬螯合劑，如EDTA(除去重金屬，解除其對酶的抑制）。,③具有蛋白質性質的大分子物質某些酶可作為激活劑來激活酶原：指可對某些無活性的酶原作用的酶，如胰

58、蛋白酶原受腸激酶作用后被激活。無活性酶原?激活作用?有活性的酶,3.4.7 抑制劑對酶促反應速度的影響酶的抑制作用的研究在新醫(yī)藥、新農(nóng)藥設計、了解酶的活性中心、酶的作用機理以及確定代謝途徑等都有重要意義。 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質稱做酶的抑制劑（inhibitor，I）。很多藥物、毒物、抗代謝物等都是酶的抑制劑。使酶蛋白變性失活（酶的鈍化）的因素稱變性劑。如強酸、強堿等，它們不屬于抑制劑。,抑制劑與酶分子上的某

59、些必須基團反應，引起酶活力下降甚至喪失，使酶反應速度降低。根據(jù)抑制劑與酶的作用方式及抑制作用是否可逆，將抑制作用分為不可逆抑制作用和可逆抑制作用。,3.4.7.1 不可逆抑制作用(irreversible inhibition) 不可逆抑制劑通常以共價鍵方式與酶的必需基團不可逆結合而使酶喪失活性，不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶恢復活性。如重金屬鹽、有機磷、疊氮化合物、氰化物、含汞、含砷有機物都是不可逆抑制劑。按其作用特點

60、，可分為專一性和非專一性兩類。,①非專一性不可逆抑制抑制劑與酶分子中一類或幾類基團共價結合，其中酶的必需基團也被抑制劑結合，導致酶的失活。某些重金屬(Pb2+、Cu2+、Hg2+)、對氯汞苯甲酸、碘乙酸等與酶分子的巰基進行不可逆適合，以巰基作為必需基團的酶（通稱巰基酶）因此而受抑制。,用二巰基丙醇(british anti lewisite, BAL)或二巰基丁二酸鈉等含巰基的化合物可使酶復活。,②專一性不可逆抑制抑制劑專一地

61、共價結合于酶的活性中心或其必需基團，從而抑制酶的活性。二戰(zhàn)中使用的DIFP（二異丙基磷酰氟）、1605、敵百蟲等都屬于專一性不可逆抑制劑。有機磷殺蟲劑能專一作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基，使其磷酰化而抑制酶活性。當膽堿酯酶被有機磷殺蟲劑抑制后，使神經(jīng)末稍分泌的乙酰膽堿不能及時分解為乙酸和膽堿，乙酰膽堿堆積會導致神經(jīng)過度興奮的中毒癥狀。,解磷定等藥物可與有機磷殺蟲劑結合，使酶和有機磷殺蟲劑分離而復活。,3.4.7.2 可逆抑制劑（

62、reversible inhibition）抑制劑與酶以非共價可逆結合，用透析的方法可除去抑制劑而使酶恢復活性。根據(jù)可逆抑制劑與酶結合部位的不同，又可將其分為三類：競爭性抑制劑、非競爭性抑制劑和反競爭性抑制劑。,⑴競爭性抑制(competitive inhibition)①競爭性抑制作用抑制劑的結構與底物極為相似，可與底物相互競爭與酶活性中心結合，降低酶活性。,已結合底物的ES復合體不能再結合I。同樣已結合抑制劑的EI復合體不能

63、再結合S。抑制作用大小取決于抑制劑與[S]比，加大[S]可減弱或消除這種抑制劑的抑制作用。,如丙二酸、蘋果酸及草酰乙酸都和琥珀酸的結構相似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。,很多藥物都是酶的競爭性抑制劑。如磺胺藥與對氨基苯甲酸具有類似的結構，磺胺藥是二氫葉酸合成酶的競爭性抑制劑，抑制細菌合成葉酸維生素，因而具有抗菌作用。,對氨基苯甲酸、二氫喋呤及谷氨酸是某些細菌合成二氫葉酸的原料，二氫葉酸轉變成的四氫葉酸是細菌合成核酸不可缺少的輔酶。由于

64、磺胺藥是二氫葉酸合成酶的競爭性抑制劑，進而減少菌體內(nèi)四氫葉酸的合成，使核酸合成障礙，導致細菌死亡?？咕鲂籽跗S氨嘧啶(TMP)能特異地抑制細菌的二氫葉酸還原為四氫葉酸，故能增強磺胺藥的作用。,②競爭性抑制的動力學,競爭性抑制中，底物活抑制劑與酶的結合都是可逆的，各存在著一個平衡。,Ki：抑制劑常數(shù)(inhibitor constant)Ki=Ki2/Ki1，為EI的解離常數(shù)Km：ES的解離常數(shù),酶不能同時與底物(S)、抑制

65、劑(I)結合：ES+I≠ESI EI+S≠ESI所以，有ES、EI，而沒有ESI∴[E]=[Ef]+[ES]+[EI]根據(jù)米氏學說原理：Vmax=K3[E] 和 V=K3[ES],為了消去[ES]項，先利用米氏公式求出[Ef]項及[EI]項：,將[Ef]代入[EI]式中,再將[Ef]及[EI]代入Vnax/V的式子中,以1/V對1/[S]作圖,加入競爭性抑制劑后的斜率為：橫軸截距為：,有競爭

66、性抑制劑存在的曲線與無抑制劑的曲線相交于縱坐標1/Vmax處，但橫坐標的截距，因競爭性抑制存在變小，說明競爭性抑制作用，并不影響酶促反應的最大速度，而使Km值變大。,⑵非競爭性抑制(non-competitive inhibition),抑制劑和底物分別結合在酶的不同部位上，抑制劑和底物對酶的結合互不影響。,抑制劑可和酶結合生成EI，也可和ES結合生成ESI；底物和酶結合成ES后，仍可與I結合生成ESI，但ESI復合物不能釋放形成產(chǎn)物P

67、。,I和S在結構上一般無相似之處，I常與酶分子上結合基團以外的化學基團結合，這種結合并不影響底物和酶的結合，增加底物濃度并不能減少I對酶的抑制程度。 這種抑制劑的抑制強度取決于抑制劑的絕對濃度，不能通過增加底物濃度來解除。,在非競爭抑制作用中存在的平衡為：,酶與底物結合后可再與抑制劑結合，酶與抑制劑結合后也可再與底物結合。,所以，這種抑制有ES，EI及ESI，∴[E]＝[Ef]+[ES]+[EI]+[ESI],以1/V對1/[S]作

68、圖,非競爭性抑制劑存在的曲線與無抑制劑存在的曲線相交于橫坐標－1/Km處，縱坐標截距，因非競爭性抑制劑的存在而變大，說明非競爭性抑制作用，并不影響底物與酶的親和力，而使酶促最大反應速度變小。,即非競爭性抑制劑與酶的活性中心之外的其他部位結合，可形成ESI復合物，降低了Vmax，而Km不變。,⑶反競爭性抑制劑這類抑制劑只能與酶和底物的復合物結合，不能與游離酶結合，形成的ESI復合物不能分解為產(chǎn)物，因此影響酶的活性。,酶必須先與底物結合，