基礎(chǔ)生物化學(xué)酶課件

1、1,第三章 酶 （enzyme）,2,掌握酶的概念及催化特性了解酶的分類及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系掌握酶的作用機(jī)理掌握酶促反應(yīng)的機(jī)理及其動(dòng)力學(xué)了解一些重要的酶類了解酶的調(diào)節(jié)方式了解維生素的重要的輔酶形式,學(xué)習(xí)目的,3,一. 酶的研究簡史,公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。1857年，巴斯德（Pasteur）：酒精發(fā)酵是酵母細(xì)胞活動(dòng)的結(jié)果；1878年，德國生理學(xué)家?guī)於魈岢雒福ㄔ醋韵ＥD語“在酵母中”）的概念。1897年，B&

2、#252;chner兄弟用不含細(xì)胞的酵母提取液實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵，證明發(fā)酵無需活細(xì)胞；,The Nobel Prize in Chemistry 1907,"for his biochemical researches and his discovery of cell-free fermentation",4,1913年，Michaelis和Menten提出酶促動(dòng)力學(xué)原理----米氏學(xué)說; 1926年，Sumner首次

3、提取出脲酶并證明其本質(zhì)是蛋白質(zhì)；,The Nobel Prize in Chemistry 1946,Sumner,Stanley,Northrop,"for their preparation of enzymes and virus proteins in a pure form","for his discovery that enzymes can be crystallized",1/

4、2 of the prize,1/4 of the prize,1/4 of the prize,5,1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶（ribozyme）的概念1995年，Jack W.Szostak研究室首先報(bào)道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme),6,酶（enzyme）：是活細(xì)胞合成的、對(duì)其特異的底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)。核酶（ribozyme）：是近年

5、來發(fā)現(xiàn)的對(duì)RNA具有高效特異催化作用的RNA，其作用主要參與RNA的剪接。脫氧核酶(deoxyribozyme)：具有催化活性的DNA,具催化作用的生物物質(zhì)：,7,酶是生物細(xì)胞產(chǎn)生的，以蛋白質(zhì)為主要成分的生物催化劑。酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱為酶促反應(yīng)（Enzymatic reaction）在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱為底物（substrate）。,二. 酶是生物催化劑（ biocatalysts ）,1. 酶的概念,1.

6、1 酶的概念,8,極高的催化效率 酶促反應(yīng)的速度比非酶促反應(yīng)通常要快105~1017 倍高度專一性 鉑：催化許多反應(yīng)，包括有機(jī)反應(yīng) H+：淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、蔗糖等 酶：作用于結(jié)構(gòu)近似的分子，甚至只催化一種化合物易失活催化活性受到調(diào)節(jié)、控制有些酶的催化活性與輔因子（cofactor）有關(guān),1.2 酶的作用特點(diǎn),9,一種酶只能作用于某一類或某一特定物質(zhì)，這就是酶的

7、專一性（specitificity）專一性主要取決于酶的活性中心的構(gòu)象和性質(zhì)酶的專一性分為兩種情況： 結(jié)構(gòu)專一性（structure specitificity ） 立體異構(gòu)專一性（stereospecitificity ）,2. 酶的專一性,10,根據(jù)酶對(duì)底物結(jié)構(gòu)的要求不同，分為相對(duì)專一性和絕對(duì)專一性。絕對(duì)專一性(absolute specificity) ：這些酶對(duì)底物有非常嚴(yán)

8、格的要求，只作用一種底物。 如脲酶只作用于尿素而不作用于其衍生物 (如尿素的甲基取代物或氯取代物) 。,2. 1 結(jié)構(gòu)專一性,11,相對(duì)專一性(relative specificity) ：酶對(duì)底物要求較低，作用的底物不至一種，對(duì)作用底物鍵的兩端的要求程度不同又可分為基團(tuán)專一性和鍵專一性。,A. 鍵專一性：酶對(duì)鍵的兩端無嚴(yán)格要求，只要求一定的鍵。如：酯酶(lipase)、二肽酶等。,12,B. 基團(tuán)專一性：又稱族專一性。酶不但要

9、求底物一定的化學(xué)鍵，而且對(duì)鍵一端的基團(tuán)也有嚴(yán)格要求。 如：?-D-葡萄糖苷酶不但要求? -糖苷鍵，并要求鍵的一端必須有葡萄糖殘基，而對(duì)另一端基團(tuán)無嚴(yán)格要求，可水解蔗糖和麥芽糖。,13,幾乎所有的酶對(duì)于立體異構(gòu)體都具有高度的專一性。酶對(duì)底物的立體構(gòu)型的特異要求，可分為旋光異構(gòu)專一性和幾何異構(gòu)專一性。旋光異構(gòu)專一性 當(dāng)?shù)孜镉行猱悩?gòu)體時(shí)，酶只作用其中的一種。如L-AA氧化酶只作用于L-AA 、L-乳酸脫氫酶的

10、底物只能是L型乳酸，而不能是D型乳酸。,2. 2 立體異構(gòu)專一性,14,例如乳酸脫氫酶是具有立體異構(gòu)特異性的酶，它能催化乳酸脫氫生成丙酮酸的可逆反應(yīng)。,15,L(+)乳酸通過其不對(duì)稱C原子上的CH3、COOH及OH基分別與乳酸脫氫酶活性中心的A、B及C三個(gè)功能基團(tuán)結(jié)合，故可受酶催化而轉(zhuǎn)變?yōu)楸?。D(-)乳酸由于OH、COOH的空間位置與L(+)乳酸相反，與酶的三個(gè)結(jié)合基團(tuán)不能完全配合，故不能與酶結(jié)合受其催化。,16,幾何異構(gòu)專一性：

11、如延胡索酸水化酶只催化延胡索酸即反-丁烯二酸水合生成蘋果酸及其逆反應(yīng)，而不催化順-丁烯二酸。,17,18,幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)，有的是簡單蛋白質(zhì)，有的是結(jié)合蛋白質(zhì)，具有蛋白質(zhì)的一切性質(zhì)。,3. 酶的化學(xué)本質(zhì),3.1 酶是蛋白質(zhì),19,單純酶： 生物活性僅決定于蛋白質(zhì)部分結(jié)合酶 由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)部分組成的酶 非蛋白部分一般是有機(jī)小分子化合物或金屬離子，稱為輔因子,

12、3.2 結(jié)合酶和輔因子,20,21,,輔酶 (coenzyme):與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。,輔基 (prosthetic group):與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。,輔助因子按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度分為：,22,金屬酶(metalloenzyme) 金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失 金屬激活酶(metal-activated enzyme) 金屬離子為酶的活性所

13、必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密金屬離子的作用 參與催化反應(yīng)，傳遞電子； 在酶與底物間起橋梁作用； 穩(wěn)定酶的構(gòu)象； 中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。,23,,,小分子有機(jī)化合物在催化中的作用,24,單體酶 (monomeric enzyme ) 單體酶只有一條多肽鏈，這一類酶很少，一般為水解酶類，相對(duì)分子質(zhì)量為13000～35000 常見的單體酶有

14、：溶菌酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶等,3.3 單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合體,根據(jù)酶蛋白分子結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)可分為單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合體。,25,寡聚酶(oligomeric enzyme) 寡聚酶由幾個(gè)甚至幾十個(gè)亞基組成，亞基相同或不同，亞基間以非共價(jià)鍵結(jié)合，用4 mol／L尿素溶液或其它方法可以把它們彼此分開。 寡聚酶的相對(duì)分子質(zhì)量從35 000到幾百萬。

15、 常見的有：磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脫氫酶等。,26,多酶復(fù)合體 (multienzyme system) 多酶復(fù)合體是由幾個(gè)酶聚合而成的復(fù)合體。一般由在系列反應(yīng)中2~6個(gè)功能相關(guān)的酶組成，它有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行，以提高酶的催化效率，同時(shí)便于機(jī)體對(duì)酶的調(diào)控。 多酶復(fù)合體相對(duì)分子質(zhì)量都很高，一般都在幾百萬以上。例如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（總相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)460 000）

16、和脂肪酸合成酶復(fù)合體。,27,28,1981年T. Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲（tetrahymena）的26S rRNA在無蛋白質(zhì)存在的情況下，具有自我拼接的催化活性。1983年，S. Altman和N. R. Pace發(fā)現(xiàn)將RNaseP）蛋白質(zhì)組分除去后，其余的RNA部分具有與全酶相同的催化活性，即可對(duì)tRNA前體進(jìn)行加工。,3.4 核酶,29,把對(duì)RNA有催化活性的RNA命名為Ribozyme，譯為核酶； 核酶的具體作用主要有

17、：1. 核苷酸轉(zhuǎn)移作用。2. 水解反應(yīng)，即磷酸二酯酶作用。3. 磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，類似磷酸轉(zhuǎn)移酶作用。4. 脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。5. RNA內(nèi)切反應(yīng)，即RNA限制性內(nèi)切酶作用。已發(fā)現(xiàn)幾十種Ribozyme。,30,三. 酶的分類和命名,氧化還原酶 Oxidoreductase 氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。

18、 如乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。,1. 酶的分類,根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型，按照國際酶學(xué)委員會(huì)，將酶分為六大類：,31,轉(zhuǎn)移酶 Transferase 轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。 例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。,32,水解酶 Hydrolase 水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。 主要

19、包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶催化的脂的水解反應(yīng),33,裂解酶 Lyase 裂解酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。 主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。,34,異構(gòu)酶 Isomerase 異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排

20、過程。 例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。,35,合成酶 Ligase or Synthetase 合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。 A + B + ATP + H-O-H ===A ? B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng) 丙酮酸 + CO2

21、 ? 草酰乙酸,36,每個(gè)酶都有一個(gè)有四個(gè)數(shù)字組成的編碼,37,系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。例如， 習(xí)慣名稱: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 系統(tǒng)名稱: 丙氨酸：?-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶,2. 酶的命名,2.1 系統(tǒng)命名法,38,根據(jù)其催化底物來命名：蛋白酶、淀粉酶根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名： 脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶結(jié)合上述兩個(gè)原則來命名：

22、 乳酸脫氫酶、草酰乙酸脫羧酶有時(shí)在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點(diǎn)： 胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶,2.2 習(xí)慣命名法:,39,四. 酶的作用機(jī)理,1. 酶的催化作用及分子活化能,40,活化態(tài)與常態(tài)之間的能量差，也就是分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)（分子過渡態(tài)）所需的能量就成為活化能酶催化作用的本質(zhì)：降低反應(yīng)活化能,,41,,Enzyme Stabilizes Transiti

23、on State,,,,S,P,ES,EST,EP,ST,,Energy change,Energy required (no catalysis),Energy decreases (under catalysis),What’s the difference?,T = Transition state,42,2. 中間產(chǎn)物學(xué)說,,+,P,+,,,,Steady State Theory,In steady state, the pr

24、oduction and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a constant.,S,E,E,43,中間產(chǎn)物學(xué)說的證據(jù)：電子顯微鏡觀察到了核酸聚合酶與核酸結(jié)合而成的復(fù)合物；根據(jù)酶和底物反應(yīng)前后的光譜變化，可證明中間產(chǎn)物的存在；D-氨基酸氧化酶與

25、D-氨基酸結(jié)合而成的復(fù)合物已被分離、結(jié)晶出來。,44,活性中心是指酶分子中直接和底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位，由結(jié)合部位和催化部位所組成。結(jié)合部位： 由有一定特性的基團(tuán)組成，一定的底物靠此部位結(jié)合到酶分子上，此部位決定酶的專一性。催化部位：由一些參與催化反應(yīng)的基團(tuán)組成，起催化作用，底物分子中的化學(xué)鍵在此部位被打斷或形成新鍵，從而發(fā)生一定的化學(xué)變化，此部位決定酶的催化高效性。,3. 酶的活性部位和必需集團(tuán),45,46,酶分子

26、中與酶活性有關(guān)的基團(tuán)稱為酶的必需基團(tuán)(essential group)。它是酶分子中表現(xiàn)催化活力所必需的部分，包括活性中心和活性中心以外的對(duì)維持活性中心空間構(gòu)象所必需的一些基團(tuán)。,47,4. 酶與底物結(jié)合形成中間絡(luò)合物的方式（理論）,4.1 鎖鑰假說(lock and key hypothesis)：,認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣,解釋了酶的立體異構(gòu)專一性；但不能

27、解釋酶的活性中心既適合可逆反應(yīng)的底物，又適合可逆反應(yīng)的產(chǎn)物。,48,該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀,4.2誘導(dǎo)契合假說（induced–fit hypothesis):,49,誘導(dǎo)契合學(xué)說的要點(diǎn),酶有其原來的形狀，不一定一開始就是底物的模板底物能誘導(dǎo)酶蛋白的形狀發(fā)生一定變化（專一性結(jié)合）當(dāng)酶的形狀發(fā)生變化后，就使得其中的催化基團(tuán)形成正確的排列。在酶反應(yīng)過程中，酶活性中心構(gòu)象的變

28、化是可逆的。即酶與底物結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生一種誘導(dǎo)構(gòu)象，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，產(chǎn)物從酶表面脫落，酶又恢復(fù)其原來的構(gòu)象。,50,鄰近效應(yīng)：在酶促反應(yīng)中，由于酶和底物分子之間的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢，最終結(jié)合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效濃度大大增加的效應(yīng)定向效應(yīng)：當(dāng)專一性底物向酶活性中心靠近時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)酶分子構(gòu)象發(fā)生改變，同時(shí)使反應(yīng)基團(tuán)之間的分子軌道以正確方向嚴(yán)格定位，使酶促反應(yīng)易于進(jìn)行。 這兩種效應(yīng)

29、使酶具有高效率和專一性特點(diǎn),5. 使酶具有高催化效率的因素,5.1 鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng),51,52,5.2 “張力”和“變形”,底物與酶結(jié)合誘導(dǎo)酶的分子構(gòu)象變化，變化的酶分子又使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”甚至“形變” ，從而使底物分子某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，降低了反應(yīng)的活化能，有助于過渡態(tài)的中間產(chǎn)物形成,53,54,廣義酸－堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子，或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過程酶活性部位

30、上的某些基團(tuán)可以作為良好的質(zhì)子供體或受體對(duì)底物進(jìn)行酸堿催化His的咪唑基，解離常數(shù)為6.0。在中性條件下以兼性離子存在，既可以作質(zhì)子供體，也可以作質(zhì)子受體，是最有效、最活潑的一個(gè)催化功能基團(tuán),5.3 酸堿催化,55,催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價(jià)催化。酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括以下親核基團(tuán)： His 的咪唑基，Cys 的巰基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等；

31、親電子基團(tuán)：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用,5.4 共價(jià)催化,56,酶活性中心內(nèi)相對(duì)地說是非極性的，也就是說酶的催化基團(tuán)被低介電環(huán)境所包圍，在某些情況下，還可能排除高極性的水分子。這樣，底物分子的敏感鍵和酶的催化基團(tuán)之間就會(huì)有很大的反應(yīng)力，這是有利于酶的加速反應(yīng)。,5.5 酶活性中心是低介電區(qū)域,57,不同的酶，其主要作用的因素可能是不同的，可能受一種或幾種因素

32、的影響,58,6. 胰凝乳蛋白酶,胰凝乳蛋白酶是一個(gè)絲氨酸蛋白酶，活性中心的ＡＡ殘基：Asp102 His57 Ser195,是研究的最早、最徹底的一個(gè)酶功能：動(dòng)物小腸中催化蛋白質(zhì)的水解,,59,Asp102,His57,Ser195,Catalytic Triad,Chymotrypsin Catalytic Mechanism A1,,,,O,Check substrate specificity,60,Asp102,His

33、57,Ser195,H,,,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism A2,O,,First Transition State,61,H,,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism A3,O,,Acyl-Enzyme Intermediate,,,62,,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism D1,O,,,Acyl-Enzyme W

34、ater Intermediate,63,,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism D2,O,H,Second Transition State,,,64,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism D3,O,,Deacylation,,65,66,類似與胰凝乳蛋白酶作用機(jī)制的還有：胰蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等。,67,沒有催化活性的酶的前體稱為酶原。如：胰蛋

35、白酶原、凝血酶原等。酶原在一定條件下轉(zhuǎn)變成有活性的酶的過程稱為酶原的激活。 酶原的激活過程常伴有酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變： 胰蛋白酶原 胰蛋白酶 + N端6肽片段,7. 酶原激活,,胰蛋白酶/腸激酶,68,69,70,71,概念 研究各種因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，并加以定量的闡述。影響因素：酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。,※ 研究一種因素的影響時(shí)，其余各因

36、素均恒定。,五. 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),72,測定單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量測定產(chǎn)物的生成量（相對(duì)準(zhǔn)確）,1. 酶反應(yīng)速度的測量,73,底物濃度降低、產(chǎn)物濃度增加逐漸促進(jìn)了逆反應(yīng)、酶本身的失活研究酶反應(yīng)速度以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn),74,在底物過量，一定溫度和pH下，酶促反應(yīng)速度與酶的濃度呈正比。酶濃度對(duì)速度的影響機(jī)理：酶濃度增加，[ES]也增加，而V=k[ES]，故反應(yīng)速度增加。,2. 酶濃度對(duì)酶作用的影響,75,3. 底物濃度對(duì)酶作用的

37、影響和米氏方程,3.1 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,76,,,,,,,,,,Increase Substrate Concentration,,,,,,,,,S+E↓P,(in a fixed period of time),77,78,中間絡(luò)合物假說,79,,Constant ES Concentration at Steady State,,,,,,S,P,E,ES,Juang RH (2004) BCbasics,80,

38、1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說對(duì)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。1925年，Brigg和Haldane對(duì)米氏方程的基本原理加以補(bǔ)充和發(fā)展，提出“穩(wěn)態(tài)假說”。,3.2 米氏方程,81,Km — 米氏常數(shù)Vmax — 最大反應(yīng)速度,82,測定的速度為反應(yīng)的初速度，即[S]消耗>[E]，[Et]=[ES]穩(wěn)態(tài)的存在,米氏方

39、程的推導(dǎo)：,83,根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說，酶促反應(yīng)分為兩步,84,85,86,Km值的推導(dǎo),當(dāng) V= Vmax / 2 時(shí),,,Km＝[S],∴Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。,87,酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)Km值表示酶與底物之間的親和程度Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值,3.3 米氏常數(shù)Km的意義,Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)

40、速度一半時(shí)的底物濃度。,88,Km最小的底物大多數(shù)是此酶的天然底物 如：己糖激酶對(duì)葡萄糖的Km 1.5mmol/L 對(duì)果 糖的Km 28mmol/L 所以葡萄糖為最適底物,89,,,,,Km: Affinity with Substrate,,,,,S2,S1,S3,,,S1 S2 S3,Vmax,1/2,When using differ

41、ent substrate,Affinity changes,,,,,90,測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法 — 雙倒數(shù)作圖法。,3.4 Km值與Vmax值的測定,91,92,An Example for Enzyme Kinetics (Invertase),,,,,Vmax,Km,,,,Double reciprocal,Direct plot,1) Use predefined amount

42、 of Enzyme → E,2) Add substrate in various concentrations→ S (x 軸),3) Measure Product in fixed Time (P/t)→ vo (y 軸),4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate→ Vmax,5) When y = 1/2 Vmax calculate x ([S]) → Km,,

43、,,1/2,93,,,A Real Example for Enzyme Kinetics,Data,no,1234,0.250.501.02.0,0.420.720.800.92,Absorbance,v (mmole/min),[S],0.210.360.400.46,(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmo

44、le(2) Reaction time was 10 min,1/S,1/v,4210.5,2.081.561.351.16,→→ → →,Direct plot,Double reciprocal,,94,例1：下列數(shù)據(jù)是對(duì)酶促反應(yīng)s→p的記錄：[s](molL-1) v(nmolL-1min-1)6.25×10-6 15.07.50×10-5

45、 56.251.00×10-4 601.00×10-3 74.91.00×10-2 751.00×10-1 75求（1）Vmax和Km (2) [s]=2.5×10-5和[s]=2.00×10-1時(shí)v等于多大。,95,例2：下列數(shù)據(jù)是對(duì)酶促反應(yīng)s

46、→p的記錄：[s](umolL-1) v(umol·min-1)0.1 0.2710.0 20.060.0 80.0200 1201000 15

47、01500 1602000 160求（1）Vmax和Km (2) [s] =1600時(shí)游離酶的濃度多大？,96,最適pH,4. pH對(duì)酶作用的影響,97,過酸 過堿影響酶蛋白的構(gòu)象，導(dǎo)致失活影響底物的解離狀態(tài)影響酶分子的解離狀態(tài)影響酶分子基團(tuán)的解離而影響酶活性中心構(gòu)象,pH影響酶作用的原因：,98,雙重影響 溫度升高，酶促反

48、應(yīng)速度升高；溫度升高10oC, 反應(yīng)速度增加一倍；（Q10） 由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低。,5. 溫度對(duì)酶作用的影響,99,最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度。 溫血?jiǎng)游铮?5～40℃ Taq DNA聚合酶：70～75℃ ，可耐受100℃高溫。此酶是從水生棲熱菌 Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性D

49、NA聚合酶，用于PCR反應(yīng)。,100,101,低溫的作用 : 貯存生物制品、菌種等 低溫時(shí)由于活化分子數(shù)目減少，反應(yīng)速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復(fù)。 臨床上的低溫麻醉 減少組織細(xì)胞的代謝程度，使機(jī)體耐受手術(shù)時(shí)氧和營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏。,102,激活劑(activator):使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)。? 必需激活劑

50、 (essential activator)? 非必需激活劑 (non-essential activator),6. 激活劑對(duì)酶作用的影響,103,無機(jī)離子 金屬離子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、 Se3+、Co2+、Fe2+ 陰離子： Cl-、Br-有機(jī)分子 還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金屬螯合劑：EDTA,10

51、4,這些離子可與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，可能是酶活性部位的組成部分，也可能作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分起作用；一般情況下，一種激活劑對(duì)某種酶是激活劑，而對(duì)另一種酶則起抑制作用；對(duì)于同一種酶，不同激活劑濃度會(huì)產(chǎn)生不同的作用。,105,酶的抑制劑(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。區(qū)別于酶的變性 抑制劑對(duì)酶有一定選擇性 引起變性的因素對(duì)酶沒有

52、選擇性,7. 抑制劑對(duì)酶作用的影響,106,酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。,107,抑制作用的類型,不可逆性抑制 (irreversible inhibition),可逆性抑制 (reversible inhibition)：,競爭性抑制 (competitive inhibition)非競爭性抑制 (

53、non-competitive inhibition)反競爭性抑制 (uncompetitive inhibition),108,抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶活性中心的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活。如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。,7.1 不可逆性抑制作用,109,有活化作用的不可逆抑制劑： 這類抑制劑以潛伏狀態(tài)存在，當(dāng)它與酶的活性中心結(jié)合以后，就被激活成有抑制活性的抑制劑。在反應(yīng)中，酶激活了這種無活力的、潛伏態(tài)的不可逆抑制劑，而自身的活力

54、完全喪失。這種抑制劑可以看作酶的“自殺性底物”。,110,抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的，抑制劑可用透析、超濾等方法除去，從而恢復(fù)酶的活性。根據(jù)抑制劑與酶的關(guān)系: 競爭性抑制 非競爭性抑制 反競爭性抑制,7.2 可逆性抑制作用,111,7.2.1 競爭性抑制,,112,某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被

55、抑制了。竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。,113,114,競爭性抑制的米氏方程,115,116,競爭性I往往是酶的底物結(jié)構(gòu)類似物；抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同—— 酶的活性中心抑制作用可以被高濃度的底物減低以致消除；(表觀）Km值增大，Vm值不變；在雙倒數(shù)圖上表現(xiàn)為： 競爭性抑制和無抑制的直線在縱軸上交于一點(diǎn)； 競爭性抑制直線斜率增大；

56、 競爭性抑制直線在橫軸上的交點(diǎn)右移；,117,118,119,7.2.2 非競爭性抑制,,120,酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競爭性抑制劑。某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制。非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。,121,122

57、,123,非競爭性抑制的米氏方程,有非競爭性抑制劑存在時(shí)，V值減小(1+[I]/Ki)倍，且V值隨[I]的增高而降低；Km值不變。,124,125,7.2.3 反競爭性抑制,,126,酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，引起酶活性下降。,127,128,有反競爭性抑制劑存在時(shí)，Km和V值均減小(1+[I]/Ki)倍，且都隨[I]的增高而降低。,反競爭性抑制的米氏方程,129,130,Enzyme Inhibition (Mechan

58、ism),Competitive,Non-competitive,Uncompetitive,E,E,,,,,,,,Different site,Compete for active site,Inhibitor,Substrate,Cartoon Guide,Equation and Description,[I] binds to free [E] only,and competes with [S];increasing [

59、S] overcomesInhibition by [I].,[I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] cannot overcome [I] inhibition.,[I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favorsthe inhibition by [I].,X,131,,Enzyme Inhibiti

60、on (Plots),,,,,,,,,,Vmax,Km,Km’,[S], mM,vo,I,I,Vmax unchangedKm increased,Vmax decreasedKm unchanged,Both Vmax & Km decreased,,,I,= Km’,,132,133,六. 酶的調(diào)節(jié),134,一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱別構(gòu)調(diào)節(jié)

61、。 別構(gòu)酶 (allosteric enzyme) 別構(gòu)部位 (allosteric site),1.2 別構(gòu)酶,1. 酶活性的調(diào)節(jié),1.1 酶原與酶原的激活,135,別構(gòu)酶的特點(diǎn)：一般是寡聚酶，由多亞基組成，包括催化部位和調(diào)節(jié)（別構(gòu)）部位；具有別構(gòu)效應(yīng)。指酶和一個(gè)配體（底物，調(diào)節(jié)物）結(jié)合后可以影響酶和另一個(gè)配體（底物）的結(jié)合能力。不符合米氏方程，呈S型曲線,136,137,138,139,,,Mechanism

62、 and Example of Allosteric Effect,A,I,,X,X,X,R = Relax(active),T = Tense(inactive),Allosteric site,Homotropic(+)Concerted,Heterotropic(+)Sequential,Heterotropic(-)Concerted,Allosteric site,Juang RH (2004) BCbasic

63、s,140,1.3 酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié),141,142,143,144,2. 酶含量的調(diào)節(jié),145,146,3. 同工酶,147,148,149,150,七. 酶的活力測定及分離提純,1. 酶活力的測定,151,152,153,154,Turn Over Numbers of Enzymes,Catalase H2O2,Carbonic anhydrase HCO3-,Acetylcholinesterase Ace

64、tylcholine,40,000,000,400,000,140,000,b-Lactamase Benzylpenicillin,2,000,Fumarase Fumarate,800,RecA protein (ATPase) ATP,0.4,Enzymes,Substrate,kcat (s-1),The number of product transformed from substrate by one

65、 enzyme molecule in one second,155,Enzyme Kinetics,Km,Vmax,&,Bi-substrate reaction alsofollows M-M equation, butone of the substrate shouldbe saturated when estimate the other,Affinity withsubstrate,Maximumvelo

66、city,Inhibition,Activity,Observe vo change under various [S], resulted plotsyield Vmax and Km,,,,,,,156,2. 酶的分離提純,157,Basic Principles of Protein Purification,Ammonium sulfate fractionation,,Organelle,,Homogeni

67、zation,Nucleic acid,Carbohydrate,(Lipid),Size,Charge,Polarity,Affinity,Small molecule,Cell Debris,,Protein,Amino acid, Sugar,Nucleotides, etc,Gel filtration,SDS-PAGE,Ultrafiltration,Ion exchange,Chromatofocusing,D

68、isc-PAGE,Isoelectric focusing,Reverse phasechromatography,Salting-out,Affinitychromatography,Hydroxyapatite,158,159,八. 酶工程簡介,1. 酶工程簡介,160,酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、