基因芯片分析

1、基因組表達(dá),芯片數(shù)據(jù)分析,,轉(zhuǎn)錄本主要包括mRNA，small RNA，non-coding RNA,生物芯片的概念是Fodor等人于1991年提出(Fodor et al., 1991, Science)。,在90年代初期，利用光原位合成的原理，在基質(zhì)上固定高密度的寡核苷酸的DNA測(cè)序芯片。 1995年Schena (Scie

2、nce, 1995)等人，把擬南芥的45個(gè)基因固定在一張玻片上，并行檢測(cè)擬南芥45個(gè)基因的表達(dá)情況，這是第一次結(jié)合了高精度機(jī)械手點(diǎn)樣系統(tǒng)、熒光標(biāo)記技術(shù)、雙通道熒光掃描技術(shù)和數(shù)據(jù)分析軟件，是第一次真正意義上的用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)分析的應(yīng)用。 部分基因組被測(cè)序的微生物全基因的DNA芯片問(wèn)世，如：釀酒酵母，大腸桿菌。 人類(lèi)、大鼠和小鼠的全基因組芯片。,基因芯片發(fā)展過(guò)程,Southern & Northern Bl

3、ot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,,,,,,5,sample,image,Data analysis,,,,,,,,,,原理 -- 通過(guò)雜交檢測(cè)信息,,,,,,,,一組寡核苷酸探針,,,,—,TATGCAATCTAG,,,,,,,,,,,,,CGTTAGAT,,ACGTTAGA,,,ATACGTTAGATC,,TACGTTAG,,由雜交位置確定的一組,核酸探針序列,,GTTAGATC,,,,,雜交探針

4、組,,TATGCAATCTAG,,重組的互補(bǔ)序列,,靶序列,,,,,,,,,TACGTTAG,,,ACGTTAGA,,,ATACGTTA,,,CGTTAGAT,,,GTTAGATC,,,,ATACGTTA,,Research Use.Clinical Diagnostic Use.,,BiologicalSample,,Functional Information,One Disease——One Gene Expres

5、sion Pattern,,,計(jì)算Ratio 值 (= Cy3/Cy5) 在 0.5-2.0 之外的定義為在兩樣本中有明顯差異表達(dá)。進(jìn)而獲取初步功能信息,Prototype AmpliOnc? I Biochip,,,,,,,,AmpliOncTM I Biochip after hybridization; color composite of red, blue and green image,This biochip cont

6、ains all genomic regions that have been reported to be amplified in cancers.,,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,X,Y,Oncogene Targets On the AmpliOnc? I Biochip,PDGFB,EGFR1,PDGFRA,MET,FGFR2,WNT1,MYB

7、,HER2,YES1,HRAS1,CND1,RAF1,GLI,MYC,MDM2,20q13,REL,MYCL1,FGR,FES,ABL,INT2,PIK3CA,NMYC,AKT2,FGFR1,JUNB,AKT1,KRAS2,CDK4,AR,,cDNA microarray expression patterns of small (S) and large (L) neurons,,mRNA enriched in large DRG

8、 neurons,,mRNA enriched in small DRG neurons,,放射性原位雜交驗(yàn)證結(jié)果,,基因芯片的數(shù)據(jù)解讀和分析,芯片圖像的處理。 芯片雜交后獲得的數(shù)據(jù)與芯片的基因信息的連接。 芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理及數(shù)據(jù)的可視化。

9、 數(shù)據(jù)處理和分析的算法。,,,下表是整理后數(shù)據(jù)的一部分,一、基因芯片數(shù)據(jù)提取與過(guò)濾,(一) cDNA微陣列芯片,,(二) Affymetrix公司的原位合成芯片,定性信息提?。篜/A/M(Present/Absent/Marginal） 定量信息提取：基于探針集匯總后的基因水平的熒光信號(hào)強(qiáng)度值,預(yù)處理對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換 目的：使數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,預(yù)處理數(shù)據(jù)過(guò)濾 去除表達(dá)水平是負(fù)值或很小的數(shù)據(jù)或者明顯的噪聲數(shù)據(jù) 波動(dòng)篩選：去掉一成

10、不變的基因，要求在一定的變化范圍內(nèi)波動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化 片內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化：去除系統(tǒng)誤差 片間標(biāo)準(zhǔn)化：在不同列之間的標(biāo)準(zhǔn)化，使每列在同一量綱上比較,,網(wǎng)格定位結(jié)果,數(shù)據(jù)過(guò)濾,數(shù)據(jù)過(guò)濾的目的是去除表達(dá)水平是負(fù)值或很小的數(shù)據(jù)、或者明顯的噪聲數(shù)據(jù)。過(guò)閃耀現(xiàn)象 物理因素導(dǎo)致的信號(hào)污染 雜交效能低點(diǎn)樣問(wèn)題其它,二、數(shù)據(jù)補(bǔ)缺,(一)數(shù)據(jù)缺失類(lèi)型非隨機(jī)缺失 基因表達(dá)豐度過(guò)高或過(guò)低隨機(jī)缺失 與基因表達(dá)豐度無(wú)關(guān)，數(shù)據(jù) 補(bǔ)缺主要針對(duì)

11、隨機(jī)缺失情況,(二)數(shù)據(jù)補(bǔ)缺方法,1、簡(jiǎn)單補(bǔ)缺法,missing values = 0 expressionmissing values = 1 expression (arbitrary signal)missing values = row (gene) averagemissing values = column (array) average,2、K近鄰法,選擇與具有缺失值基因的k個(gè)鄰居基因用鄰居基因的加權(quán)平均估計(jì)缺失值

12、參數(shù):鄰居個(gè)數(shù)距離函數(shù),3、回歸法,三、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,(一)為什么要進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化存在不同來(lái)源的系統(tǒng)誤差染料物理特性差異(熱和光敏感性，半衰期等)染料連接效能點(diǎn)樣針差異數(shù)據(jù)收集過(guò)程中掃描設(shè)施不同芯片差異實(shí)驗(yàn)條件差異,,,,(二)運(yùn)用哪些基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理芯片上大部分基因(假設(shè)芯片上大部分基因在不同條件下表達(dá)量相同) 不同條件間穩(wěn)定表達(dá)的基因(如持家基因)控制序列(spiked control ) 合成DN

13、A序列或外源的DNA序列，在不同條件下表達(dá)水平相同。,,,以M (log ratio 表達(dá)量)為縱坐標(biāo)，A(log intensity 表達(dá)量)為橫坐標(biāo)做出數(shù)據(jù)的散點(diǎn)分布圖。,A = (Log Green + Log Red) / 2,M = Log Red - Log Green,,,低,高,表達(dá)水平,調(diào)控方向,上調(diào),下調(diào),1、片內(nèi)標(biāo)化(Within-slide normalization)全局標(biāo)化(Global normaliz

14、ation),(三) cDNA芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理,假設(shè)： R=k*G方法:C=log2k：中值或均值,芯片內(nèi)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的常用方法是局部加權(quán)回歸分析：Lowess (LocallyWeighted Linear Regression) normalization 。,Lowess 回歸分析是一種非參數(shù)回歸方法，也稱(chēng)為平滑方法，在計(jì)算兩個(gè)變量的關(guān)系時(shí)采用開(kāi)放式算法，不套用現(xiàn)成的函數(shù)公式，所擬合的曲線(xiàn)可以很好的描述變量之間關(guān)系的細(xì)微的

15、變化。,,,從圖中可以看出由于染色的紅光強(qiáng)度比綠光強(qiáng)度大，因此數(shù)值的整體分布趨勢(shì)是偏離那條斜線(xiàn)的。這是由于紅光和綠光的感應(yīng)強(qiáng)度不同產(chǎn)生的偏差。因此希望基因的紅光強(qiáng)度與綠光強(qiáng)度是一致的。所以所有數(shù)值點(diǎn)的總體分布趨勢(shì)應(yīng)該和圖中斜線(xiàn)是相吻合的。這樣通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化后所有數(shù)值點(diǎn)的擬合曲線(xiàn)應(yīng)該下移至斜線(xiàn)位置。,,,lowess in R,out=lowess(x,y,f=0.4) plot(x,y) lines(out$x,out$y,col=

16、2,lwd=2,out$x will be a vector containing the x values.out$y will contain the lowess fitted values for the values in out$x.f controls the fraction of the data used to obtain each fitted value.f = 0.4 has been recom

17、mended for microarray data normalization.,2、片間標(biāo)化(Multiple-slide normalization)平均數(shù)、中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化(mean or median normalization)尺度調(diào)整的標(biāo)準(zhǔn)化 （ Scale Normalization）分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化 （Quantile Normalization） 兩張芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)的分位數(shù)標(biāo)化至相同，即分布于對(duì)角線(xiàn)上。

18、線(xiàn)性標(biāo)化法(Linear scaling methods) 與芯片內(nèi)標(biāo)化的尺度調(diào)整(Scale adjustment) 方法類(lèi)似非線(xiàn)性標(biāo)化法(non-linear methods)分位數(shù)標(biāo)化法(Quantile normalization),3、染色互換實(shí)驗(yàn)(dye-swap experiment ) 的標(biāo)化 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組

19、 芯片1 cy5(R) cy3(G’) 芯片2 cy3(G) cy5(R’)前提假設(shè)：c︽c’方法:,,,,M = log2R - log2GA = (log2R + log2G)/2,,,Slide 2Cy3 Cy5,Slide 1Cy3 Cy5,median,Q3=75th percentile,Q1=25th percentile,minimum,maxi

20、mum,,,,,,前面提及的標(biāo)準(zhǔn)化方法僅效正了數(shù)據(jù)分布的中心，在不同的柵格間log-Ratios 的方差也不同。,,（腳標(biāo)a 為每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)）,channel.medians=apply(log(x),2,median)normalized.log.x=sweep(log(x),2,channel.medians),R腳本,Scale Normalization,在進(jìn)行片內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，不同grid中的基因強(qiáng)度的分布不一致，亦即基因強(qiáng)度

21、值的離散程度不同，這是由系統(tǒng)誤差帶來(lái)的。所以理想狀態(tài)下希望它們的離散程度是一致的。同理對(duì)于雙色channel的情況在理想狀態(tài)下基因在兩個(gè)染色channel中的離散程度也應(yīng)該是一致的。因此對(duì)于雙色芯片數(shù)據(jù)的尺度標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果就是基因在兩個(gè)channel中的中值一致，同時(shí)基因染色強(qiáng)度在兩種channel中的離散程度一致。,Log Mean Signal (centered and scaled),Data after Median Center

22、ing and Scale Normalizing,medians=apply(X,2,median) Y=sweep(X,2,medians) mad=apply(abs(Y),2,median) const=prod(mad)^(1/length(mad)) scale.normalized.X=t(t(X)*(const/mad)),差異表達(dá)分析(Analysis of Differentially Expres

23、sion Gene ),一、倍數(shù)法,實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)值,對(duì)照條件下的表達(dá)值,通常以2倍差異為閾值，判斷基因是否差異表達(dá),,,,,,,[mRNA] ~ Cy5/Cy3 = r,time / h,,,,,,,,,,,1,5,0,_,_,,Start of experiment,up-regulationinduction,down-regulationrepression,,,,combine them in the log (base

24、 2) ratio Log2( Red intensity / Green intensity)Ratio= log2 (R/G),推測(cè)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,,,H0 ：所研究的基因在表達(dá)量上與正常表達(dá)時(shí)的表達(dá)量沒(méi)有顯著的差異性。H1： 在兩種或兩種以上樣本的芯片實(shí)驗(yàn)中，基因的表達(dá)有顯著的差異性,,,,芯片實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),二、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,1、t檢驗(yàn)法,,運(yùn)用t檢驗(yàn)法可以判斷基因在兩不同條件下的表達(dá)差異是否具有顯著性,2、方差分析,,,,

25、,,,,方差分析可用于基因在兩種或多種條件間的表達(dá)量的比較，它將基因在樣本之間的總變異分解為組間變異和組內(nèi)變異兩部分。通過(guò)方差分析的假設(shè)檢驗(yàn)判斷組間變異是否存在，如果存在則表明基因在不同條件下的表達(dá)有差異。,三、SAM (Significance Analysis of Microarrays),(一) 多重假設(shè)檢驗(yàn)問(wèn)題Ⅰ型錯(cuò)誤（假陽(yáng)性）即在假設(shè)檢驗(yàn)作推斷結(jié)論時(shí)，拒絕了實(shí)際上正確的檢驗(yàn)假設(shè)，即將無(wú)差異表達(dá)的基因判斷為差異表達(dá)。Ⅱ型

26、錯(cuò)誤（假陰性）即不拒絕實(shí)際上不正確的，即將有差異表達(dá)的基因判斷為無(wú)差異表達(dá)。在進(jìn)行差異基因挑選時(shí)，整個(gè)差異基因篩選過(guò)程需要做成千上萬(wàn)次假設(shè)檢驗(yàn)，導(dǎo)致假陽(yáng)性率的累積增大。對(duì)于這種多重假設(shè)檢驗(yàn)帶來(lái)的放大的假陽(yáng)性率，需要進(jìn)行糾正。常用的糾正策略有Bonferroni效正，控制FDR（False Discovery Rate）值等。,差異表達(dá)基因篩選，越寬越嚴(yán)格，越窄越寬松SAM (Significance Analysis of Micr

27、oarrays),數(shù)據(jù)的初步分析 －差異基因的選擇,一般來(lái)說(shuō)，ratio>2或ratio2表示比率在平均比率加兩倍方差之外，差異基因有了統(tǒng)計(jì)意義。 T-檢驗(yàn)（ t-test ），從重復(fù)芯片中識(shí)別差異的表達(dá)基因。 SAM (Significance Analysis of Microarrays )。 ANOVA()?，F(xiàn)在識(shí)別差異基因方法不是很完善，它仍是數(shù)據(jù)處理中的一個(gè)熱點(diǎn)。,數(shù)據(jù)的深入分析－ 聚類(lèi)分析,層次聚類(lèi)算法

28、將研究對(duì)象按照它們的相似性關(guān)系用樹(shù)形圖進(jìn)行呈現(xiàn)，進(jìn)行層次聚類(lèi)時(shí)不需要預(yù)先設(shè)定類(lèi)別個(gè)數(shù)，樹(shù)狀的聚類(lèi)結(jié)構(gòu)可以展示嵌套式的類(lèi)別關(guān)系。的基因可能具有共同的特征。,探索完全未知的數(shù)據(jù)特征的方法層次聚類(lèi)(hierarchical cluster)K-means 基于向量的SOM主成分分析(PCA),層次聚類(lèi),,k均值聚類(lèi),,隨機(jī)的兩個(gè)點(diǎn),MiRNA 表達(dá)譜：非癌樣品(正常樣品,腺瘤,息肉)vs癌,57,,癌樣品,癌和非癌樣品之間存在明顯的

29、譜帶差異,常用的表達(dá)譜分析軟件(General Microarray Analysis Software ),ArrayTools DChip（DNA-Chip Analyzer） SAMR語(yǔ)言和BioConductor: affy、marray、limma Matlab: Bioinformatics Toolbox,安裝sam-3.02.ex以后，打開(kāi)Excel，在加載項(xiàng)的工具欄中會(huì)出現(xiàn)Stanford Tools，點(diǎn)擊L

30、oad SAM，即可導(dǎo)入SAM及SAM Controller的快捷按鈕。,After finishing installation,基因芯片數(shù)據(jù)獲取,Gene Expression Omnibus (GEO)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,基因芯片數(shù)據(jù)獲取,Gene Expression Omnibus (GEO)GPLXXXXGSMXXXXGSEXXXXGDSXXXX,,,,,實(shí)驗(yàn)組,G

31、EO自己組織的相近實(shí)驗(yàn),基因芯片數(shù)據(jù)獲取,ArrayExpresshttp://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/,Install Bioconductor Packages,Install RInstall a selection of core Bioconductor packages>source("http://bioconductor.org/biocLite.R")&

32、gt; biocLite()Install a particular package, e.g., limma> biocLite("limma")> biocLite(c("GenomicFeatures", "AnnotationDbi")),User Guides and Package Vignettes,http://svitsrv25.epfl.c

33、h/R-doc/doc/html/packages.html,Expression Profiling Analysis,Preprocessing: Oligonucleotide Arrayslibrary("affy")ReadAffy(); #input dataexpresso(); #Background adjustment,Normali

34、zation,SummarizationjustRMA(); #more efficientexprs(); library(simpleaffy) ampli.eset <- call.exprs(cel,"mas5",sc = target) qcs <- qc(cel,ampli.eset),67,Express

35、ion Profiling Analysis,Preprocessing: Two-Color Spotted Arrayslibrary(limma)read.maimages(); #input databackgroundCorrect(); #Background adjustmentnormalizeWithinArrays();

36、 #Normalize within arraysnormalizeBetweenArrays(); #Normalize between arraysexprs.MA(); #Extract expression valuesavereps(); #SummaryplotMA(); # MA plot,68,Expression Profiling Analysis,Non-speci

37、fic filteringIntensity-basedvariability across samplesfraction of Present callsR packages：genefilter,69,Differentially expressed geneslibrary(samr)samr(); #Significance analysis of microarra

38、yslibrary(multtest)mt.rawp2adjp(); #Adjusted p-values for simple multiple # testing procedureslibrary(limma)lmFit(); #Linear Model for Series

39、 of ArrayseBayes(); #Empirical Bayes Statistics for #Differential Expression,70,Expression Profiling Analysis,Clustering and visualization library(amap) hc

40、luster(); #Hierarchical Clustering #more efficient than hclust()dist(); #Distance Matrix Computation library(ctc)r2gtr(); #Write t

41、o gtr, atr, cdt file format for Treeviewr2atr()r2cdt()library("gplots")heatmap.2(); #extensions to the standard R heatmap(),71,Expression Profiling Analysis,,#setwd("/var/www/html/SRP/");

42、inputFile=Arguments[1];#outputFile=Arguments[2];library(affy)mydata head(pm.data) GSM94592.CEL GSM94593.CEL GSM94594.CEL GSM94595.CEL GSM94596.CEL64704 4418.0 2931.0 3576.8 3065.5 3270.

43、864705 124.3 114.5 126.0 170.3 139.364706 152.0 131.8 160.3 197.5 172.064707 109.3 102.3 118.0 140.0 125.064708

44、 89.3 100.0 95.0 130.8 106.064709 80.0 79.3 78.0 99.0 76.0,GSM199463.CEL.gz0GSM199464.CEL.gz0GSM199465.CEL.gz1GSM199466.CEL.gz1GSM1994

45、67.CEL.gz2GSM199468.CEL.gz2GSM199469.CEL.gz3GSM199470.CEL.gz3GSM199471.CEL.gz4GSM199472.CEL.gz4,,mm.data <- mm(mydata) head(mm.data) # Mis-match probes GSM94592.CEL GSM94593.CEL GSM94

46、594.CEL GSM94595.CEL GSM94596.CEL65238 3263.5 1918.8 3107.8 2418.0 2319.865239 164.8 118.0 152.0 151.5 145.065240 90.5 78.0 89.3

47、 109.8 92.365241 79.3 79.3 88.0 106.3 84.065242 94.0 86.0 94.8 119.0 95.565243 72.3 79.0 77.0

48、 88.0 89.0 head(geneNames(mydata)) # ProbeSet names[1] "10000_at" "10001_at" "10002_i_at" "10003_f_at" "10004_at" [6] "10005_at" sampleName

49、s(mydata) # Sample namespdat <- pData(mydata)) # Phenotypic dataeset.rma <- rma(mydata)emat.rma.log2 <- exprs(eset.rma)class(emat.rma.log2)write.table(emat.rma.log2, file="emat.rma&qu

50、ot;, quote=F, sep="\t", col.names=T, row.names=F) write.exprs(eset,file="eset.txt"),,,,library(samr) samfit <- SAM(emat.rma.nologs[present.probes,c(1,2,7,8)], c(1,1,2,2), resp.type="T

51、wo class unpaired", genenames=present.probes)R分析差異表達(dá)基因的library有很多，但目前運(yùn)用最廣泛的Bioconductor包是limma。差異表達(dá)基因分析是根據(jù)表型協(xié)變量（分類(lèi)變量）鑒定組間差異表達(dá)，它屬于監(jiān)督性分類(lèi)的一種。在鑒定差異表達(dá)基因以前，一般需要對(duì)表達(dá)值實(shí)施非特異性過(guò)濾（在機(jī)器學(xué)習(xí)框架下屬于非監(jiān)督性分類(lèi)），因?yàn)檫m當(dāng)?shù)姆翘禺愋赃^(guò)濾可以提高差異表達(dá)基因的檢出率、甚至是

52、功效，結(jié)果內(nèi)容包括AveExpr值（比較組間絕對(duì)值的平均差異值）、logFC值（差異倍數(shù)）、t值、P值、q值（即adj.P.Val值）和B值。一般logFC值、P值、q值和AveExpr值用來(lái)作為差異表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，比如差異倍數(shù)在2倍以上、絕對(duì)差異表達(dá)在10以上、P值小于0.01等,,,http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html,,,,,,數(shù)據(jù)起始位