常用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹

1、常用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹(2011042311:01:29)轉(zhuǎn)載▼標(biāo)簽：分子生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)常用實(shí)用技術(shù)基本實(shí)驗(yàn)室技術(shù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教育常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等

2、）可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。固相雜交固相雜交（solidphasehybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖

3、維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。斑步雜交（dothybridization）是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。該法的特點(diǎn)是操作簡單，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測；根據(jù)斑點(diǎn)雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點(diǎn)是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。印

4、跡雜交（blottinghybridization）是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價(jià)結(jié)合于支持物表面，與平均長度為2050nt的混合RNA或cDNA探針進(jìn)行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個(gè)數(shù)量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達(dá)特征，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點(diǎn)。液相雜交（solutionhbr

5、idization）指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。遞減雜交（subtractivehybridizatio）是利用兩種來源一致而功能不同的組織細(xì)胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）在一定的條件下以過量的驅(qū)動(dòng)mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA

6、進(jìn)行液相雜交，通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達(dá)的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫，可獲得特異表達(dá)的目的基因cDNA全長序列。核酸原位雜交用特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞級或組織切片中核酸進(jìn)行復(fù)性雜交并對其實(shí)行檢測的方法，稱為核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）。用來檢測DNA在細(xì)胞核或染色休上的分布，與細(xì)胞內(nèi)