es-cells

1、胚胎干細(xì)胞建系方法的研究,,1,胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells）,來(lái)自于體外培養(yǎng)的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）抑制分化和促進(jìn)自我更新的條件下培養(yǎng)具有無(wú)限增殖、自我更新和多向分化潛能,2,胚胎干細(xì)胞的研究,胚胎干細(xì)胞研究起源于對(duì)胚胎癌細(xì)胞的研究1981年：首次獲得小鼠胚胎干細(xì)胞系；1995年：建立首株靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞系；1998年：人類(lèi)胚胎干細(xì)胞建系；,3,小鼠ES細(xì)胞,Self-renewalPlur

2、ipotencyChimerasGerm lineage,Pluripotency can be defined as the ability at the single cell level to initiate formation of all somatic cell lineages and the germ cells,已建立的小鼠胚胎干細(xì)胞系,5,小鼠胚胎干細(xì)胞的建系,胚胎收集： 早期胚胎、囊胚； 培養(yǎng)條件：抑制分

3、化、促進(jìn)增殖； 挑選集落、進(jìn)行傳代； 獲得純度高、能穩(wěn)定傳代并維持未分化狀態(tài)的全能性的ESCs；,小鼠ES細(xì)胞建系方法：,6,囊胚ICM細(xì)胞分離：,7,超排小鼠，合籠，檢栓沖八細(xì)胞胚胎（E2.5）體外胚胎培養(yǎng)至囊胚接種分離細(xì)胞全胚培養(yǎng)法（Embryo culture）免疫外科法（Immunosurgery）顯微外科法（Microsurgery）,全胚培養(yǎng)法：模擬胚胎體內(nèi)附植的過(guò)程，使胚胎貼附到基質(zhì)或滋養(yǎng)層上并脫去透明

4、帶，而后消化克隆擴(kuò)增細(xì)胞;,8,免疫外科法：去透明帶后，使裸胚與兔抗鼠抗體、兔補(bǔ)體作用，滋養(yǎng)層細(xì)胞破裂溶解，分離ICM細(xì)胞。,AT treatment (Removal of the zone pellucida) ImmunosurgeryRabbit anti mouse serumRabbit complement Stripping,9,ES細(xì)胞體外培養(yǎng)：,有滋養(yǎng)層培養(yǎng)法小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(ME

5、F)SNL小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥(niǎo)嘌呤和耐烏苯苷亞系(STO）轉(zhuǎn)染neo抗性基因和LIF基因的STO細(xì)胞(SNL),,,,抑制分化促進(jìn)增殖,無(wú)滋養(yǎng)層培養(yǎng)法LIF或其他分化抑制因子條件培養(yǎng)基（大鼠心肌條件培養(yǎng)基、BRL培養(yǎng)基等）,10,滋養(yǎng)層細(xì)胞：,11,,小鼠ES培養(yǎng)體系,LIF & serum & Feeder3i/2i & LIF,12,GSK3 inhibitor: Chir99021

6、 FGF/MEK/ERK inhibitor: PD184352 SU5402 PD0325901,Current Stem Cell Research & Therapy, 2006, 1, 103-111,14,相對(duì)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系（LIF+Serum），2i培養(yǎng)體系可以獲得純度較高的小鼠胚胎干細(xì)胞（Nanog、Oct4等多能性標(biāo)記蛋白表達(dá)較高）；,應(yīng)用2i/3i體系建立了難建小鼠品

7、系的ES細(xì)胞系,15,ES細(xì)胞傳代：,(ESCs小集落，4×),(ESCs克隆，4×),挑選形態(tài)典型、細(xì)胞分化較少、較大的集落。用玻璃針或毛細(xì)玻璃管分離 下來(lái)，于消化液 中消化，分散細(xì)胞團(tuán)。消化的條件需要摸索。第一次傳代時(shí)不要消化至單細(xì)胞，以免傳代 后難以形成集落。,16,ES細(xì)胞鑒定：,1. 形態(tài)學(xué)鑒定：細(xì)胞核大，核質(zhì)比高。體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長(zhǎng)。細(xì)胞克隆呈島狀或巢狀。,2.

8、特異性抗原檢測(cè)：SSEA、Oct-4、Nanog、Sox-2等特異性蛋白,3. AP活性檢測(cè)： ESCs 具有高的堿性磷酸酶活性。,6. 嵌合試驗(yàn)：證明ESCs具有全能發(fā)育的潛能。,5. 分化能力檢測(cè)：體外/體內(nèi)分化檢測(cè),4. 核型分析： ESCs具有二倍體正常的核型。,17,囊胚注射法8細(xì)胞注射法,小鼠ES細(xì)胞→嵌合小鼠,Miguel et al. Biology of Reproduction, 2009(80):

9、1216-1222,18,,4細(xì)胞、8細(xì)胞融合培養(yǎng)法,19,Stephen et al.PNAS,1993(90):4582-4585,2008年，分離大鼠囊胚ICM，應(yīng)用MEF/3i培養(yǎng)獲得大鼠胚胎干細(xì)胞系。,大鼠胚胎干細(xì)胞的建系,20,Rat ES Cells Derived and Maintained in 3i Conditions Express Pluripotency Markers,21,Expression of c

10、ell surface markers in mouse, rat, and human ES cells.,22,Chimeras and Germline Offspring Produced from Rat ES Cells,23,(A)Five chimeras generated by injection of DAc2 rat ES cells into F344 rat blasto