direct survival role of vascular endothelial growth factor on rat ovarian follicular cells

1、Directsurvivalroleofvularendothelialgrowthfactonratovarianfollicularcells前言雌性生殖系統(tǒng)是研究成體血管發(fā)生的一個有趣的模型，因為它面臨著許多生成血管的過程加上周期進化和衰退（卵巢，子宮內(nèi)膜，胎盤結(jié)構(gòu)）。相反，維管系統(tǒng)在其他組織是普遍靜止的，除了傷口愈合和一些病例條件下。VEGF家族和他的受體在血管發(fā)生中構(gòu)成了一個重要的信號通路在近20年來研究的比較深入。七個家族成

2、員已經(jīng)被鑒定，VEGFA到E。胎盤生長因子（PIGF）1和2，他們都是通過三酪氨酸激酶受體，VEGFR1到3發(fā)信號的。特別的，VEGFA(通常被稱為VEGF)在血管發(fā)生中是主要的參與因子，VEGFR2KDR是主要的受體。VEGFactingthroughFlk1KDRisacrucialphysiologicalcomponentinfolliculargrowthbeingnecessaryftheionofrecruitedantr

3、alfollicles。在牛，豬，鼠類卵巢中，VEGF在早期卵泡發(fā)育過程中表達，而且在卵泡生長的全部過程中在顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞表達量增加。我們最近的研究表明VEGF蛋白和其受體VEGFR2KDR，在大鼠卵泡的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中有高表達。一些研究已經(jīng)對在卵泡發(fā)育中VEGF的功能進行研究。在小鼠上，用一種特殊的抗體抑制KDR來抑制促性腺激素依賴的卵泡血管發(fā)生并且阻攔成熟卵泡的發(fā)育。服用VEGFTRAP，一種來自猴的可溶性VEGF受體，

4、可以使卵泡血管發(fā)生減弱，F(xiàn)LT1和KDR受體發(fā)育減緩。而且，在早期卵泡發(fā)育中加入抗VEGFR2抗體可以干擾卵泡的正常發(fā)育。（MeovertheadministrationofanantiVEGFR2antibodyintheearlyfollicularphaseinterfereswiththenmaldevelopmentofthecohtofrecruitedantralfollicles）。在恒河猴卵泡內(nèi)注射VEGF拮抗劑可以降

5、低排卵和后續(xù)的黃體發(fā)育及其功能。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)用Trap處理來抑制VEGF可以使抗細(xì)胞凋亡的比例失調(diào)：在大鼠卵巢中可以導(dǎo)致大量卵泡閉鎖的凋亡前的蛋白。除了它的促血管生成作用，在不同的細(xì)胞中VEGF還是一個存活因子。特別是它在內(nèi)皮細(xì)胞通過它的受體KDR促進有絲分裂，這在體內(nèi)和體外都以證明。但是，這個因子同時還能在神經(jīng)元中起到保護細(xì)胞的作用，通過抑制凋亡，刺激神經(jīng)形成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到gliotrophic作用，并且在局部缺血后

6、，在肌細(xì)胞起到存活因子的作用。近幾年，還報道VEGF在小鼠胚胎時期對眼的發(fā)育和晶狀體的分化有直接的作用。但是，迄今為止，很少由關(guān)于VEGF在大鼠卵巢細(xì)胞的存活因子的角色，特別是在早期卵泡和顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)中。已經(jīng)指出在牛卵泡中可能充當(dāng)存活因子的角色，通過它的KDR受體，在牛卵巢中通過抑制顆粒細(xì)胞的凋亡來抑制卵泡閉鎖。VEGF通過它的主要受體VEGFR2KDR在內(nèi)皮細(xì)胞形成了一個多樣的，網(wǎng)絡(luò)狀的信號通路，產(chǎn)生了多功能性。這個VEGF促進細(xì)胞

7、存活的主要的通路是P13K依賴的抗細(xì)胞凋亡激酶和AKT蛋白激酶B的激活。VEGF也可以在其他細(xì)胞中激活P13AKT途徑，例如神經(jīng)元和平滑肌細(xì)胞。另外，VEGF是ERKs1和2的強烈的活化劑，通過KDR在血管發(fā)生和細(xì)胞存活中起著重要作用。但是，還沒有報道關(guān)于卵泡細(xì)胞中VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)，通過TRAPintrabursaladministration抑制VEGF可在大鼠卵泡中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增生，調(diào)節(jié)卵泡生長和

8、發(fā)育，P13KAKT信號通路是這個機制中的一種。但是，我們不能說明這個影響在體內(nèi)發(fā)生是通過血管延伸減少或者是抑制卵泡細(xì)胞中VEGF與它的受體間的相互作用。我們的主要目的是研究來自DES處理的大鼠的卵泡和顆粒細(xì)胞中VEGF的直接的存活作用。我們特別研究了體外在早期卵泡和顆粒細(xì)胞中VEGF在卵泡細(xì)胞增殖和凋亡的作用不同的方法處理）中的PCNA進行免疫印跡分析。卵泡培養(yǎng)在沒有刺激物，含有FSH20ngmlVEGF50ngml100ngml的基

9、本培養(yǎng)基中。光密度測定法分析。5個獨立實驗，3次重復(fù)。星號表示顯著差異。3.2在體外研究中，VEGF抑制細(xì)胞凋亡，降低卵泡細(xì)胞中caspase3的活性細(xì)胞凋亡后期，細(xì)胞DNA斷裂成180bp長的碎片，可以在瓊脂糖凝膠中觀察出來。由于自然凋亡，卵巢培養(yǎng)24小時后，可以觀察到典型的凋亡細(xì)胞的DNA降解。早以前的研究中，我們證實了通過TRAP處理抑制VEGF可以導(dǎo)致大量的卵泡閉鎖。因此我們接著研究VEGF是否能直接調(diào)控卵泡閉鎖。兩種劑量的VE

10、GF（50，100ngml）都能明顯降低細(xì)胞凋亡的DNA碎片，高濃度的劑量最用更明顯。（圖2A）.FSH同樣可以降低自然凋亡。、圖2在體外研究中，VEGF抑制細(xì)胞凋亡，降低卵泡細(xì)胞中caspase3的活性。(A)在24小時中通過不同的刺激（FSHVEGF50ngml100ngml）用瓊脂糖凝膠分析早期卵泡DNA片段圖，鑒定細(xì)胞凋亡。（B）在卵泡中密度計量caspase3活性片段。caspase3蛋白可以用抗caspase3抗體直觀的現(xiàn)象

11、出來。我們觀察到卵泡細(xì)胞中VEGF可以減少細(xì)胞凋亡，我們接著研究了這種抑制是否伴隨著caspase3活性的降低。我們對卵泡中的蛋白提取物中的caspase3的活性片段進行了westernblot。VEGF濃度物50ngml時，減少了caspase3的p17活性片段，與對照組比較。FSH有相同的作用。意外的是，我們不能檢測出對照組和加了100ngmlVEGF的實驗組的差別，可能是VEGF有雙向的作用。3.3VEGF刺激顆粒細(xì)胞增殖為了研究

12、VEGF對細(xì)胞的保護作用是直接作用與顆粒細(xì)胞的細(xì)胞因子，我們離體培養(yǎng)了顆粒細(xì)胞并培育與不同的條件下，如上所述。我們首先用3HThyine核素?fù)饺敕ǚ治隽思?xì)胞的增值指數(shù)。得到同時用FSH和雌二醇，能增加Thyine。有趣的是，當(dāng)加入50ngml或100ngml的VEGF時，顆粒細(xì)胞的增殖效果會增強。圖3VEGF對顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。（A）從早期卵泡分離的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)在不含刺激物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加有FSH和E2，加有FSHE250n

13、gmlVEGF或100ngmlVEGF。（B）用tunel染色鑒定凋亡細(xì)胞。這些柱形顯示了不同處理下的凋亡細(xì)胞的百分比。3.4VEGG抑制顆粒細(xì)胞凋亡知道了在卵泡中VEGF可以抑制卵泡細(xì)胞凋亡，我們通過tunel染色，進一步研究了在離體顆粒細(xì)胞中是否會發(fā)生細(xì)胞凋亡。就像前面描述的那樣，將顆粒細(xì)胞放入FSH和雌二醇中孵育，的確可以降低凋亡細(xì)胞的百分比。另外，加入50ngmlVEGF作用比加入100ngmlVEGF作用更明顯。而100ngm

14、l的作用與50或其他加入刺激物的實驗組的作用沒有顯著的區(qū)別。（圖3B）3.5VEGF激活了AKT和ERK的胞內(nèi)途徑我們研究VEGF對卵泡存活和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的機制。因此，我們研究了VEGF的作用是否影響了卵泡P13KAKT途徑。我們首先將卵泡孵育在基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有FSH含有50VEGF含有100VEGF的不同處理中1小時。之后，我們用westernblot鑒定了總的AKT和磷酸化的AKT。如（圖4A）所示，當(dāng)將卵泡孵育在含有100ngml