dna重組技術(shù)基本工具

1、布雷斯塔警長,鷹的眼睛,狼的耳朵,豹的速度,熊的力量,1.1DNA重組質(zhì)技術(shù)的基本工具,專題一：基因工程,基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子水平,人類需要的基因產(chǎn)物,剪切,→ 拼接,→ 導(dǎo)入,→ 表達(dá),基因重組,基因工程,基因工程操作的四個(gè)基本步驟,1）提取目的基因2）目的基因與運(yùn)載體結(jié)合3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）目的基因的檢測(cè)和表達(dá),基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：,普通棉花(無抗蟲基因),蘇云金芽孢桿菌

2、,,提取,抗蟲基因,與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入,,,,棉花細(xì)胞(含抗蟲基因),轉(zhuǎn)基因棉花植株,上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？,,,,,,剪刀限制性核酸內(nèi)切酶,針線DNA連接酶,,運(yùn)載體,所需工具,識(shí)別某種雙鏈DNA分子____________，使每一條鏈中兩個(gè)核苷酸之間的____________斷開。(具專一性),主要是從__________中分離純化出來的。,約4000種,1、來源：2、種類：3、作用：4、結(jié)果：

3、5、命名,形成兩種末端,,黏性末端,平末端,原核生物,特定的核苷酸序列,磷酸二酯鍵,P7問題2,一、限制性內(nèi)切酶,,“分子手術(shù)刀”,2. 簡式: A — P ～ P ～ P,,,腺苷,磷酸基團(tuán),高能磷酸鍵,30.54KJ/mol,1. 中文全稱: 三磷酸腺苷,ATP分子中具有高能磷酸鍵,一分子ATP中含有的腺苷、高能磷酸鍵和磷酸基團(tuán)的數(shù)目依次為A、1，3，2 B、1，2，1

4、 D、2，3，1,C、1，2，3,ATP的水解過程,A–P～P P,,為生命活動(dòng)提供能量,細(xì)胞分裂、營養(yǎng)物質(zhì)吸收神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)、肌肉收縮,,～,,1、組成元素：,三、核酸的分子結(jié)構(gòu),2、基本單位：核苷酸,,,脫氧核糖核苷酸,,核糖核苷酸,3、核苷酸鏈,,脫氧核糖核苷酸鏈——2條核糖核苷酸鏈——1條,,4、核酸,,DNARNA,C、H、O、N、P,核酸,,水解,核苷酸,核苷酸分子簡式,兩種核苷酸比較,,,五碳糖為

5、脫氧核糖時(shí)為脫氧核糖核苷酸（簡稱脫氧核苷酸） 五碳糖為核糖時(shí)為核糖核苷酸,,DNA,RNA,,,,,,堿基的種類,腺嘌呤 A 鳥嘌呤 G 胞嘧啶 C 胸腺嘧啶 T 尿嘧啶 U,核酸中共有多少種堿

6、基？,DNA,RNA,DNA: A . G . C . T,RNA: A . G . C . U,T,磷酸二酯鍵,,A,,大腸桿菌(EcoRI)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。,,限制酶,,,,,,EcoRI限制酶的切割：,,,,,中軸線,黏性末端,黏性末端,,,,,在G與A之間切割,大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。,,黏性末端：被限制酶切開的DNA兩條

7、單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,平末端是如何形成的？,當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。,,,SmaI限制酶的切割：,只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。,當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。,當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端。,要想獲得某個(gè)目的基因必須要用限

8、制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？一個(gè)目的基因有幾個(gè)黏性末端？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端，兩個(gè)。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端。,是不是把兩者的黏性末端黏合起來，這樣就真的合成 重組的DNA分子了?,實(shí)際還不夠,還需要DNA連接酶進(jìn)行連接。,思考題：,二、 DNA連接酶—— “分子縫合針”,1、種類：2、作用部位：3、結(jié)果：,兩類,磷酸二酯鍵,兩個(gè)相同的黏

9、性末端的連接,連接黏性末端,連接黏性末端和平末端,DNA連接酶連接黏性末端之間的 磷酸二酯鍵，形成重組的DNA分子。,,,DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 —“分子運(yùn)輸車”,常用的運(yùn)載體主要有兩類： 1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒,運(yùn)載體條件：,1.能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定保存；2.具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)以便與外源基因相連；3.具有標(biāo)記基因，如抗

10、四環(huán)素的抗性基因。便于進(jìn)行鑒定和篩選．4.對(duì)受體細(xì)胞無害，容易分離，大小合適,,能帶著插入的目的基因一起復(fù)制,,有切割位點(diǎn),,標(biāo)記基因的作用鑒別受體細(xì)胞中是否含目的基因。如將來可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別，將含目的基因的細(xì)胞篩選出來。,,運(yùn)載體的作用:,一：將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。二：利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對(duì)外源基因進(jìn)行復(fù)制。,,噬菌體侵染細(xì)菌的動(dòng)態(tài)過程：,,,,,,侵入別的細(xì)菌,注入DNA,合成,吸附,組裝,釋放,1.以下說法正

11、確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、DNA連接酶使黏性末段的堿基之間形成氫鍵,C,練習(xí),2.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制 （

12、 ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀DNA,D,練習(xí),,下列四個(gè)DNA分子片段，可能是同一種限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的黏性末端的一組是A．①② B．②③ C．③④ D．②④,D,3.有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種 B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)

13、入受體細(xì)胞 D、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體,B D,練習(xí),練習(xí),4、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ）同種限制酶 B. 兩種限制酶同種連接酶 D. 兩種連接酶5、基因工程常用的受體細(xì)胞有（ ）(1)大腸桿菌 （2）枯草桿菌（3）支原體 （4）動(dòng)植物細(xì)胞A. （3）（4） B. （1）（2）（4）C.

14、 （2）（3）（4） D. （1）（2）（3）,,,,6、 基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá),C,練習(xí),2和7能連接形成…AC

15、GT…               …TGCA…；4和8能連接形成…GAATTC…              …CTTAAG…；

16、3和6能連接形成…GCGC…              …CGCG…；1和5能連接形成…CTGCAG…              …GAC

17、GTC…。,教材P7思考與探究1,2. 生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵 。,3.提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒，即獨(dú)立于細(xì)菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是

18、否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實(shí)不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。（1） 載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。（2） 載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。（3） 載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重

19、組后進(jìn)行重組子的篩選。（4） 載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。（5） 載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。,作業(yè)：,一、基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì),通過體外____和____等技術(shù),賦予生物以心得遺傳特性,創(chuàng)造出符

20、合人們的需要的新的____和____.又叫做DNA的重組技術(shù) .二、DNA重組技術(shù)的基本工具 1.限制性核酸內(nèi)切酶-----”分子手術(shù)刀” (1)主要來源:從____生物中分離出來的. (2)特點(diǎn):能夠識(shí)別DNA特定的核苷酸序列,切開,兩個(gè)____之間的_____ . (3) DNA末端:限制酶切割DNA產(chǎn)生的DNA末端有兩種形式:______和_______. 2. DNA連接酶--

21、--”分子縫合針” (1)作用:將雙鏈DNA____,恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的______. (2)種類: ①E.coli DNA連接酶:只能縫合DNA的_____ ②T4 DNA連接酶:既可縫合DNA的_____,又可縫合雙鏈DNA的_______.,3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體----”分子運(yùn)輸車” (1)載體的種類 ①質(zhì)粒:是一種裸露的,結(jié)構(gòu)簡單,獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外,并能夠