mtt實驗原理、步驟、注意事項

1、MTT實驗實驗原理；原理；步驟；步驟；注意事項；注意事項；一、原理一、原理MTT全稱為3(45)dimethylthiahiazo(zy1)35diphenytetrazoliumroe，漢語化學名為3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Fmazan）并沉積在

2、細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。缺點缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準確性

3、產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT溶液的配制方法：通常，此法中的MTT濃度為5mgml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在

4、用酶標儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT吸光度最好在00.7范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mgml保存在20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成

5、的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl8g＋Kcl0.2g＋Na2HPO41.44g＋KH2PO40.24g調(diào)pH7.4定容1L。二、幾種二、幾種MTT法實驗步驟法實驗步驟普通普通MTT法實驗步驟法實驗步驟：1：接種細胞接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔100

6、010000個細胞（細胞濃度的問題見后面的注意事項）接種到96孔板，每孔體積200ul.2:培養(yǎng)細胞培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)35天（可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間）。3：呈色呈色：培養(yǎng)35天后，每孔加MTT溶液（5mgml用PBS配制，pH=7.4)10ul.繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清多敏感性降低，太少觀察不到差異。因此，很多高手總結(jié)出“寧少勿多寧少勿多”的原則，這一

7、原則在大多數(shù)情況下是適用的。對于體積大，增殖快的細胞，比如腫瘤細胞，在96孔板中不能接種太多數(shù)目的細胞。一般應該少于104個孔。同時，細胞貼壁后不可培養(yǎng)過久，以防過于密集。大多數(shù)腫瘤細胞最佳點板濃度在40005000孔，太少的話SD值會很大。對于體積小，增殖慢、懸浮的細胞，在96孔板中可以接種更多數(shù)目的細胞。甚至可以超過105個孔。同時，為了觀察藥物對這類細胞的效果，可以較上一種細胞培養(yǎng)更長時間。在做腫瘤細胞的時候，往往要根據(jù)細胞生長速

8、度以及藥物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養(yǎng)時間是48小時還是72小時.(2)設置調(diào)零孔設置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基100ul、MTT10ul、二甲基亞砜100ul）。(3)設置空白孔設置空白孔（細胞、藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液共100ul、10ulMTT、100ul二甲基亞砜）。(4)MTT實驗吸光度吸光度最后要在00.7之間，超出這個范圍就不是直線關系。(5)96孔板邊緣邊緣32孔用無菌孔用無菌PBS填充填充因為邊緣的32孔中水

9、分蒸發(fā)很快，藥物易被濃縮，對實驗影響大。同時加入pbs液填充后，可以一定程度上保持中間孔的水分。(6)防止藥物與防止藥物與MTT反應。反應。如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、VitE、VitC，那建議你用PBS將細胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是你不需要的。(7)吸收值分析吸收值分析在理想的MTT實驗中，如果是細胞抑制實驗，不加藥物處理的空白組空白組的吸收值應該在吸收值應該在0.81.