產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)海洋菌的篩選和相關(guān)酶的研究.pdf

1、海洋中蘊(yùn)藏著豐富的物質(zhì)和微生物資源，其中，聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate：PHA）是存在于海洋微生物體內(nèi)的一種生物材料，具有生物可降解性，生物相容性等特性，可廣泛地用于環(huán)保、醫(yī)療等領(lǐng)域。早在1926年，法國(guó)的科學(xué)家 Lemoigne首次在巨大芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了 PHA的最常見單體：聚羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate：PHB），從此開啟了PHA的研究之旅。本研究從海邊土壤樣品中分離得到了一株可以利

2、用甲醇產(chǎn)PHB的菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，甲醇濃度的優(yōu)化，對(duì)PHB合成途徑中的三個(gè)基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)、純化、酶活測(cè)定及關(guān)鍵酶的定點(diǎn)突變研究。
　　從海洋土壤樣品中分離得到了一株以甲醇為唯一能源和碳源合成PHB的菌株，提取其基因組，擴(kuò)增該菌株的16S rRNA基因序列并用該序列構(gòu)建了進(jìn)化樹，結(jié)果表明分離得到的這株菌屬于Methylobacterium菌屬，將其命名為Methylobacteriumsp.1805。探索了最適菌株生長(zhǎng)

3、的起始甲醇濃度，甲醇補(bǔ)加濃度，菌株對(duì)甲醇的耐受性及降解能力，最適PHB積累的甲醇起始濃度。結(jié)果表明：將菌接在含0.4％甲醇的生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，每天補(bǔ)加0.5%的甲醇最利菌的生長(zhǎng)，在該條件下，菌株在72h OD600值可達(dá)7，進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)。該菌也有良好的甲醇耐受性，在含4%甲醇的培養(yǎng)液中仍能良好地生長(zhǎng)，對(duì)甲醇的降解能力也很強(qiáng)。將菌接到含0.5%甲醇的產(chǎn)物積累培養(yǎng)液中，每天補(bǔ)加0.5%的甲醇，適宜菌株積累PHB。在優(yōu)化的條件下，該菌株能夠積

4、累51.8%菌體干重的PHB，有工業(yè)應(yīng)用的潛力。
　　通過分析Methylobacterium中phaA、phaB、phaC三個(gè)基因的同源序列，設(shè)計(jì)引物，從Methylobacteriumsp.1805中擴(kuò)增三個(gè)基因，測(cè)定其序列并將三個(gè)基因連接到pET-28a(+)表達(dá)載體上，誘導(dǎo)表達(dá)三個(gè)酶，測(cè)定酶活及動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，并對(duì)三個(gè)酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用RF（restriction free）克隆的方式對(duì)PhaC潛在的關(guān)鍵氨基酸（341的

5、Cys、496的Asp、524的His）進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)定突變體的酶活。使用同源對(duì)比設(shè)計(jì)的引物，成功擴(kuò)增出了三個(gè)基因，將其提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為KY229163、KY229164、KY229165。測(cè)定的PhaA酶活為0.41U，Vmax與Km值分別為0.15μM min-1mg-1和0.25mM，該酶屬于cond-enzymes超家族，通過“ping pong”催化機(jī)制，將2分子乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為一分子乙酰乙酰輔酶A，整個(gè)催

6、化過程是由“Cys89-His348-Cys378”催化域完成。測(cè)定的PhaB酶活為1.64U，Vmax與Km值分別為0.48μM min-1mg-1和1.21mM，該酶屬于NADB-Rossmann超家族中的短鏈醇脫氫酶。測(cè)定的PhaC酶活為33.51U，Vmax與Km值分別為0.1μM min-1mg-1和0.14 mM，屬于PhaC-N超家族的I類PhaC，通過SWISS-MODEL對(duì)PhaC進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明克隆的PhaC與