以離子液體為功能單體的碳納米管表面Bt蛋白分子印跡聚合物的制備及其性能研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis, Bt）殺蟲晶體蛋白，是Bt芽孢形成初期產(chǎn)生的具有特異性殺蟲活性的伴胞晶體蛋白，簡稱 Bt蛋白，又稱δ-內(nèi)毒素。Bt蛋白引起的相關人類健康和環(huán)境生態(tài)風險問題，要求我們必須對轉(zhuǎn)基因作物和生物農(nóng)藥釋放Bt蛋白的種類和含量，及其在環(huán)境中的殘留、遷移、轉(zhuǎn)化和生物富集過程實行嚴格監(jiān)控，而快速、準確、高效以及特異性提取、分離、純化和檢測方法的建立對Bt蛋白的有效監(jiān)控具有舉足輕重的作用和意

2、義。
　　分子印跡技術(shù)是指以目標分析物為模板，采用人工方法合成對目標分析物具有特殊結(jié)合位點及空間記憶效應的聚合物的技術(shù)。表面分子印跡技術(shù)是在傳統(tǒng)的包埋法基礎上發(fā)展起來的，其特點是在聚合體系中引入固體基質(zhì)，使模板分子、功能單體和交聯(lián)劑之間的反應發(fā)生在固體基質(zhì)表面。這種構(gòu)建在基質(zhì)表面的分子印跡聚合物，由于印跡位點易于暴露在基質(zhì)表面，因此目標分析物可以在基質(zhì)表面形成的特異性識別位點中自由進出，以克服傳統(tǒng)包埋法在蛋白質(zhì)分子印跡方面存在的缺

3、陷。溶膠-凝膠技術(shù)反應條件溫和、表面修飾過程簡單、材料剛性和溶脹情況優(yōu)于聚合物材料，將溶膠-凝膠技術(shù)與表面分子印跡技術(shù)相結(jié)合可以給分子印跡材料賦予更多優(yōu)越的性能。
　　由于制備分子印跡聚合物過程中需要使用大量的高純度蛋白質(zhì)作為印跡模板，考慮到 Bt蛋白標準品價格昂貴，本論文從蘇云金芽胞桿菌菌體培養(yǎng)液中提取 Bt Cry1Ac蛋白，然后對提取的粗蛋白進行酶解，得到高純度的Bt Cry1Ac蛋白；以 Bt Cry1Ac蛋白為模板分子，

4、KH550修飾的碳納米管為基質(zhì)，氯化1-三甲氧基硅丙基-3-甲基咪唑離子液體（[TMSPMIM]Cl）為功能單體，四乙氧基硅烷（TEOS）為交聯(lián)劑，采用溶膠-凝膠法在碳納米管表面接枝一層Bt Cry1Ac蛋白分子印跡聚合物，并對合成及吸附條件進行優(yōu)化，對合成的分子印跡聚合物的比表面積、表面形貌、印跡效果以及表面基團等進行評價。主要內(nèi)容如下：
　　1. Bt Cry1Ac蛋白的獲取經(jīng)歷了菌體培養(yǎng)、洗芽孢、蛋白提取、等電點沉淀、酶解、

5、等電點沉淀以及冷凍干燥等多個步驟。菌體培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫28℃；轉(zhuǎn)速200 r/min；培養(yǎng)時間72 h。Bt Cry1Ac蛋白提取液為pH110.05 mol/L NaCO3&0.05 mol/L EDTA溶液。等電點沉淀條件：3 mol/L CH3COONa調(diào)節(jié)pH值至5.5左右。酶解條件：胰蛋白酶溶液與Bt Cry1Ac蛋白粗提液最佳比例為1：150，酶解時間1.5 h，酶解溫度37℃。
　　2.分子印跡聚合物合成時各反應物

6、的最佳配比為：Bt Cry1Ac蛋白12.5 mg，[TMSPMIM]Cl180 mg，TEOS2.5 mL，pH9.9 Tris-HCl緩沖溶液25 mL，KH550修飾碳納米管10 mg。首先，功能單體和模板分子Bt Cry1Ac蛋白預聚合12 h，然后再加入TEOS在4℃的條件下磁力攪拌48 h；洗脫蛋白的最佳條件：超聲5 min，pH9.9 Na2CO3-NaHCO3溶液作為洗脫緩沖液，洗脫率可以達到68.45％；吸附的最佳條件