western_blot的原理、操作及注意事項(xiàng)[1]

1、WesternWesternblotblot的原理、操作及注意事項(xiàng)的原理、操作及注意事項(xiàng)原理：原理：通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進(jìn)行檢測，蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的選擇和制備一、抗原的選擇和制備A：樣品的制備：樣品的制備1組織：組織的處理方法

2、：組織洗滌后加入3倍體積預(yù)冷的PBS，0℃研磨，加入5STOPbuffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins離心，取上清。加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于20℃保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。2細(xì)胞：細(xì)胞的處理方法：離心收集細(xì)胞或者直接往細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5STOPbuffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mi

3、ns離心，取上清。加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于20℃保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。3分泌蛋白的提?。ㄌ乩褐苯邮占置谝海尤毽翸E、溴酚藍(lán)制樣。B：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因1.雙縮脲法：雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法。在需要快速，但不很準(zhǔn)確的測定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對蛋白質(zhì)提純的早期階段是非常有利

4、的。雙縮脲法的原理是Cu2與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5gL～10gL含量的蛋白質(zhì)溶液測定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris、Good緩沖液等。可用沉淀法除去干擾物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1mNaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定。2.Lowry法：此法是雙縮脲法的進(jìn)一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng)

5、，即Cu與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物，然后這個絡(luò)合物還原磷鉬磷磷鎢酸試劑（福林酚試劑），結(jié)果得到深藍(lán)色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測定20mgL～400mgL含量的蛋白質(zhì)溶液。其干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質(zhì)的存在會使結(jié)果嚴(yán)重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時(shí)要特別小心，試劑只在酸性pH環(huán)境中才穩(wěn)定，上述提到的還原反應(yīng)只有在pH10時(shí)才發(fā)生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu2蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須

6、立刻攪拌，以使磷鉬酸磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2蛋白質(zhì)絡(luò)合物所還原。3.紫外吸收法：大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，因此，利用這個特異性吸收，可以計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。如果沒有干擾物質(zhì)的存在，在280nm處的吸收可用于測定0.1～0.5mgml含量的蛋白質(zhì)溶液。部分純化的蛋白質(zhì)常含有核酸，核酸在260nm波長處有最大吸收。有核酸時(shí)，所測得的蛋白二、二、SDSS

7、DS聚丙烯酸胺凝膠電泳（聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDSSDS－PAGEPAGE）A：實(shí)際操作：實(shí)際操作1.做膠前的準(zhǔn)備1)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。3)按將要檢測的抗體對應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計(jì)算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。2.制膠，電泳1）裝好架子。2)按照下面配方配制分離膠。(單位：ml，Total：8ml)7.5％10％15%2Sep.bu

8、ffer44430％Gel.sol2.02.74ddH2O1.91.20TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul80ul80ul在膠上面加入一層蒸餾水，促進(jìn)膠更好的凝集。3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。(單位：ml，Total：3.5ml)3％2Stacking.buffer1.730％Gel.sol0.35ddH2O1.4TEMED5ul10%APS50ul倒好后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。4)待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60

9、80V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時(shí)，用100120V電壓。一般電泳時(shí)間在1.5小時(shí)左右。B：注意事項(xiàng)及常遇到的問題：注意事項(xiàng)及常遇到的問題1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。2）上樣蛋白量不應(yīng)超過30ugmm2(載荷面即：如果你的膠槽是5mm1mm，則載荷面為：1mm5mm=5mm2)。3）gel通常在0.51h內(nèi)凝集最好，過快表示TEMED、APS用量過多，此時(shí)膠太硬易龜裂，而且電泳時(shí)容易燒膠。太慢則說明兩種