質(zhì)粒構(gòu)建小竅門

1、重組質(zhì)粒構(gòu)建是常用的分子生物學(xué)手段，其實(shí)只是最基本的方法，一般一個(gè)星期同時(shí)構(gòu)建三二個(gè)組質(zhì)粒是沒(méi)有問(wèn)題的。在國(guó)內(nèi)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)中，也大都是由實(shí)驗(yàn)員搞定。但是其中還是有些基本的技巧需要掌握。在這里將我的心得分享于大家，這也是我本人幾年來(lái)一線工作時(shí)的經(jīng)驗(yàn)積累，以期能為谷友提供借鑒，讓大家在實(shí)驗(yàn)中少走彎路。所涉及內(nèi)容如下：1)克隆基因的酶切位點(diǎn)問(wèn)題2)載體酶切的問(wèn)題3)連接片段濃度比的問(wèn)題在闡明上述問(wèn)題同時(shí)，本人盡可能舉些實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題案例予以說(shuō)明。

2、一、克隆基因的酶切位點(diǎn)問(wèn)題1、克隆位點(diǎn)選擇的問(wèn)題。首先要對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)掃描分析，列出其所含酶切位點(diǎn)清單。然后對(duì)照質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，所選擇的克隆位點(diǎn)必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點(diǎn)。這是常識(shí)，不贅述。2、保護(hù)堿基數(shù)目的問(wèn)題。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入酶切位點(diǎn)后，常常要加入保護(hù)堿基，這是大家所熟知的。但是保護(hù)堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會(huì)大大影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個(gè)保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以

3、正常進(jìn)行；而有一類，僅僅只加入兩個(gè)保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就不能正常進(jìn)行，這是因?yàn)閮?nèi)切酶不能正常結(jié)合DN段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個(gè)保護(hù)堿基，常用的HindIII也要三個(gè)。下面是我提供這類酶的列表及其所需最少的保護(hù)堿基數(shù)，相信下列將有助于大這家的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。NcoI4NdeI6NheI3NotI8PmeI6SacI3SalI3SmaI3HindIII3BstI8一般實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)上都說(shuō)質(zhì)粒：片段＝1：3（摩爾比），在實(shí)際操作中我以

4、為在1：5甚至1：10為宜。做好“一、二”，16℃10小時(shí)后，每次都能有效地連接上。當(dāng)然還有大腸桿菌感受覺(jué)態(tài)問(wèn)題，我們以前自己做，現(xiàn)在懶得做了，都用“天為時(shí)代公司”的產(chǎn)品，感覺(jué)還不錯(cuò)（特別聲明我不是天為公司內(nèi)線，呵呵）。這里介紹一個(gè)估測(cè)處DNA濃度的方法：DNA可以用紫外法檢測(cè)，也可以電泳對(duì)比marker估測(cè)，在要求不是很精確情況下，大家不妨試試下面方法：1取一平皿。2薄薄倒一層含有EB的瓊脂糖膠，凝固(4℃可以存一個(gè)星期)。3平皿背面