質(zhì)粒構(gòu)建小竅門

1、重組質(zhì)粒構(gòu)建是常用的分子生物學(xué)手段，其實(shí)只是最基本的方法，一般一個星期同時構(gòu)建三二個組質(zhì)粒是沒有問題的。在國內(nèi)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)中，也大都是由實(shí)驗(yàn)員搞定。但是其中還是有些基本的技巧需要掌握。在這里將我的心得分享于大家，這也是我本人幾年來一線工作時的經(jīng)驗(yàn)積累，以期能為谷友提供借鑒，讓大家在實(shí)驗(yàn)中少走彎路。所涉及內(nèi)容如下：1)克隆基因的酶切位點(diǎn)問題2)載體酶切的問題3)連接片段濃度比的問題在闡明上述問題同時，本人盡可能舉些實(shí)驗(yàn)中的問題案例予以說明。

2、一、克隆基因的酶切位點(diǎn)問題1、克隆位點(diǎn)選擇的問題。首先要對目標(biāo)基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)掃描分析，列出其所含酶切位點(diǎn)清單。然后對照質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，所選擇的克隆位點(diǎn)必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點(diǎn)。這是常識，不贅述。2、保護(hù)堿基數(shù)目的問題。在設(shè)計(jì)PCR引物時，引入酶切位點(diǎn)后，常常要加入保護(hù)堿基，這是大家所熟知的。但是保護(hù)堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會大大影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以

3、正常進(jìn)行；而有一類，僅僅只加入兩個保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就不能正常進(jìn)行，這是因?yàn)閮?nèi)切酶不能正常結(jié)合DN段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個保護(hù)堿基，常用的HindIII也要三個。下面是我提供這類酶的列表及其所需最少的保護(hù)堿基數(shù)，相信下列將有助于大這家的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。NcoI4NdeI6NheI3NotI8PmeI6SacI3SalI3SmaI3HindIII3BstI8一般實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊上都說質(zhì)粒：片段＝1：3（摩爾比），在實(shí)際操作中我以

4、為在1：5甚至1：10為宜。做好“一、二”，16℃10小時后，每次都能有效地連接上。當(dāng)然還有大腸桿菌感受覺態(tài)問題，我們以前自己做，現(xiàn)在懶得做了，都用“天為時代公司”的產(chǎn)品，感覺還不錯（特別聲明我不是天為公司內(nèi)線，呵呵）。這里介紹一個估測處DNA濃度的方法：DNA可以用紫外法檢測，也可以電泳對比marker估測，在要求不是很精確情況下，大家不妨試試下面方法：1取一平皿。2薄薄倒一層含有EB的瓊脂糖膠，凝固(4℃可以存一個星期)。3平皿背面