rna提取一般步驟總結

1、RNA提取一般步驟總結RNA提取原理：|通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。RNA提取的一般步驟所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還

2、牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制最關鍵的是抑制RNA酶活性酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA留在水相。第一種提取方法將導致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。實驗步驟：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。1、破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸

3、胍、NP40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入βME可以抑制RNA酶活性。2、分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH5.2）或異丙醇。4、洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。5、融解RNA一般使用TE。6、保存RNA應該盡量低溫。為了

4、防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解

5、RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12000g離心5分鐘。I氯化鋰法提取總RNA：本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高小RNA片斷丟失的缺陷。試驗試劑：1、氯化鋰尿素溶液【氯化鋰126g(3M)尿素、360g

6、(6M)加水至1L，過濾滅菌】2、懸浮液【10mMTrisHCL(pH7.6)1mMEDTA(pH80)0.5%SDS】試驗步驟：1、對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞（107個細胞ml），則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉移至Eppendof管中。2、螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很

7、強的結合多酚化合物的能力，其結合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強。原花色素類物質中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復合物，使原花色素類物質不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時pH值是一個重要的影響因素，在pH8.0以上時PVP結合多酚的能力會迅速降低。當原花色素類物質量較大時，單獨使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結合使用

8、。3、Tris硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依氫鍵形成復合物，從而抑制酚類物質的氧化及其與抑制酚類物質的氧化及其與RNA的結合的結合。這一方法十分有效，所以LбpezGбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris硼酸濃度過高（＞0.2M）則會影響RNA的回收率。4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質與BSA間可產生類似于抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的

9、復合物，減小了原花色素類物質與RNA結合的機會，因此提高了RNA的產量。BSA與PVPP結合使用提取效果會更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時要加入肝素以抑制RNase的活性。5、丙酮法：Schneiderbauer等用70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質量的RNA。酚類化合物的去除：通過Li或Ca2沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PV

10、P、不溶性PVPP或BSA結合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時除去。Manning利用高濃度的2丁氧乙醇（50％）來沉淀RNA，而多酚溶解于2丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％2丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認為即使多酚被氧化，其氧化產物仍可以溶解在高濃度2丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。多糖的干擾及對策：多糖的污染是提取植物RNA時常遇到的另一個棘手的問題。植物組織中往往富含多

11、糖，而多糖的許多理化性質與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時RNA也被裹攜走了，造成RNA產量的減少；而在沉淀RNA時，也產生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進一步的分子生物學研究。在常規(guī)的方法中，通過通過SDS鹽酸胍處理可以部分去除一鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖些多糖；在高濃度在高濃度Na或K離子存在條件下，

12、通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會發(fā)現(xiàn)有相當多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時多糖污染的問題。用低濃度乙醇沉淀多糖用低濃度乙醇沉淀多糖是一個去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多糖沉淀下來，而RNA仍保留于溶液中。

13、一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質莖中提取RNA時，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉淀多糖的，進一步純化了RNA樣品。另一個常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時在勻漿上清液中加入13體積的5M醋酸鉀（pH4.