itraq技術簡述

1、iTRAQ技術簡述技術簡述1.研究背景研究背景1994年，MarcWilkins在Siena雙向凝膠電泳（twodimensionalelectrophoresis，2DE）會議上最早提出了蛋白質組（proteome）概念，并于1995年7月的Electrophesis雜志上發(fā)表。隨著高通量、高靈敏度、高分辨率生物質譜技術的出現(xiàn)，蛋白質組學技術取得飛速發(fā)展，人們不再滿足于對一個細胞或組織的蛋白質進行定性研究，而是著眼于蛋白質量的研究，于

2、是蛋白質組學概念就被提出，并得到了廣泛的應用。蛋白質組學（Proteomics）是蛋白質（protein）與基因組學（genomics）兩個詞的組合體，表示“一種基因組所表達的全套蛋白質”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。蛋白質組學研究，就是要把一個基因組表達的絕大多數(shù)蛋白質或一個復雜的混合體系中絕大多數(shù)蛋白質進行精確的定量和鑒定。蛋白質組本質上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白

3、與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識。蛋白質組學是一門以全面的蛋白質性質研究為基礎，在蛋白質水平對疾病機理、細胞模式、功能聯(lián)系等方面進行探索的科學。目前最新的iTRAQ蛋白定量分析技術在此基礎上被提出，并被得到廣泛應用。僅僅知道蛋白質的身份并不足以對蛋白質給出最終定論，因為蛋白質的濃度對于實現(xiàn)其在細胞中的功能來說極其重要，一種特殊蛋白質在濃度上的變化，就能預示細胞的突變過程。因此，科學家

4、能夠對蛋白質的相對和絕對濃度進行測量，是很重要的事情。過去，科學家通常先進行二維(2D)凝較電泳，切斷條帶，再用質譜方法測量條帶中的蛋白質?？墒牵@種方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精確。新澤西醫(yī)學及牙科大學的蛋白組學研究中心主任HongLi說：“當我們開始蛋白組學研究時，就采用2D凝膠技術，但得出的信息量卻讓大伙很失望，因為許多蛋白質已經(jīng)改變了自身的代謝過程，如熱休克蛋白或者是管家蛋白。”蛋白組學中的方法一直在不斷提高。基于

5、高度敏感性和精確性的串聯(lián)質譜方法，不需要凝膠，就可以獲得相對和絕對定量的蛋白質結果。定量蛋白組學是蛋白質組學的一個重要組成部分，即對一對基因組表達的全體蛋白或一復雜的混合物體系中所有蛋白質進行定量和鑒定。常用的定量蛋白質組學的研究方ITRAQ標記試劑盒。所采用的iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學物質，包括三部分：一端是報告部分（reptergroup），另一端是肽反應部分（peptidereactivegroup），中間部分是平衡部

6、分（balancegroup）。其中，reptergroup：質量為114Da、115Da、116Da、117Da，因此iTRAQ試劑共四種。peptidereactivegroup：將reptergroup與肽N端及賴氨酸側鏈連接，幾乎可以標記樣本中所有蛋白質。balancegroup：質量為31Da、30Da、29Da、28Da，使得四種iTRAQ試劑分子量均為145Da，保證iTRAQ標記的同一肽段mz相同。2.2操作流程操作流程

7、iTRAQ的操作程序如下：將蛋白質裂解為肽段，然后用iTRAQ試劑進行差異標記。再將標記的樣本相混合，這樣就可以對其進行比較。與樣本結合后，通常用MudPIT多維蛋白質鑒定技術進行下一步的操作，用2D液相色譜串聯(lián)質譜進行分析。在質譜分析鑒定特殊肽離子片斷結構的基礎上，采用美國應用生物系統(tǒng)公司的軟件包MOT和ProteinPilot對每一個肽段進行鑒定。其具體操作如下圖所示：iTRAQ技術對檢測標本也有一定要求。它要求檢測蛋白量最低不少于