itraq技術(shù)簡(jiǎn)述

1、iTRAQ技術(shù)簡(jiǎn)述技術(shù)簡(jiǎn)述1.研究背景研究背景1994年，MarcWilkins在Siena雙向凝膠電泳（twodimensionalelectrophoresis，2DE）會(huì)議上最早提出了蛋白質(zhì)組（proteome）概念，并于1995年7月的Electrophesis雜志上發(fā)表。隨著高通量、高靈敏度、高分辨率生物質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)取得飛速發(fā)展，人們不再滿足于對(duì)一個(gè)細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性研究，而是著眼于蛋白質(zhì)量的研究，于

2、是蛋白質(zhì)組學(xué)概念就被提出，并得到了廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是蛋白質(zhì)（protein）與基因組學(xué)（genomics）兩個(gè)詞的組合體，表示“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究，就是要把一個(gè)基因組表達(dá)的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系中絕大多數(shù)蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白

3、與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)研究為基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)水平對(duì)疾病機(jī)理、細(xì)胞模式、功能聯(lián)系等方面進(jìn)行探索的科學(xué)。目前最新的iTRAQ蛋白定量分析技術(shù)在此基礎(chǔ)上被提出，并被得到廣泛應(yīng)用。僅僅知道蛋白質(zhì)的身份并不足以對(duì)蛋白質(zhì)給出最終定論，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的濃度對(duì)于實(shí)現(xiàn)其在細(xì)胞中的功能來(lái)說(shuō)極其重要，一種特殊蛋白質(zhì)在濃度上的變化，就能預(yù)示細(xì)胞的突變過(guò)程。因此，科學(xué)家

4、能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的相對(duì)和絕對(duì)濃度進(jìn)行測(cè)量，是很重要的事情。過(guò)去，科學(xué)家通常先進(jìn)行二維(2D)凝較電泳，切斷條帶，再用質(zhì)譜方法測(cè)量條帶中的蛋白質(zhì)?？墒?，這種方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精確。新澤西醫(yī)學(xué)及牙科大學(xué)的蛋白組學(xué)研究中心主任HongLi說(shuō)：“當(dāng)我們開始蛋白組學(xué)研究時(shí)，就采用2D凝膠技術(shù)，但得出的信息量卻讓大伙很失望，因?yàn)樵S多蛋白質(zhì)已經(jīng)改變了自身的代謝過(guò)程，如熱休克蛋白或者是管家蛋白。”蛋白組學(xué)中的方法一直在不斷提高?；?/p>

5、高度敏感性和精確性的串聯(lián)質(zhì)譜方法，不需要凝膠，就可以獲得相對(duì)和絕對(duì)定量的蛋白質(zhì)結(jié)果。定量蛋白組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要組成部分，即對(duì)一對(duì)基因組表達(dá)的全體蛋白或一復(fù)雜的混合物體系中所有蛋白質(zhì)進(jìn)行定量和鑒定。常用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方ITRAQ標(biāo)記試劑盒。所采用的iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學(xué)物質(zhì)，包括三部分：一端是報(bào)告部分（reptergroup），另一端是肽反應(yīng)部分（peptidereactivegroup），中間部分是平衡部

6、分（balancegroup）。其中，reptergroup：質(zhì)量為114Da、115Da、116Da、117Da，因此iTRAQ試劑共四種。peptidereactivegroup：將reptergroup與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈連接，幾乎可以標(biāo)記樣本中所有蛋白質(zhì)。balancegroup：質(zhì)量為31Da、30Da、29Da、28Da，使得四種iTRAQ試劑分子量均為145Da，保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段mz相同。2.2操作流程操作流程

7、iTRAQ的操作程序如下：將蛋白質(zhì)裂解為肽段，然后用iTRAQ試劑進(jìn)行差異標(biāo)記。再將標(biāo)記的樣本相混合，這樣就可以對(duì)其進(jìn)行比較。與樣本結(jié)合后，通常用MudPIT多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)進(jìn)行下一步的操作，用2D液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。在質(zhì)譜分析鑒定特殊肽離子片斷結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的軟件包MOT和ProteinPilot對(duì)每一個(gè)肽段進(jìn)行鑒定。其具體操作如下圖所示：iTRAQ技術(shù)對(duì)檢測(cè)標(biāo)本也有一定要求。它要求檢測(cè)蛋白量最低不少于