基于iTRAQ技術(shù)對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的初探.pdf

1、肝癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其中70％-90%為肝細(xì)胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）。全世界范圍內(nèi)年肝癌死亡人數(shù)約為74.5萬，占癌癥致死率的第三位。其中我國(guó)的新增病例和死亡病例均占全球的一半。肝癌臨床治療失敗及死亡率高的主要原因是大部分病例初次診斷即有轉(zhuǎn)移，據(jù)統(tǒng)計(jì)80%以上的患者最終死于肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移。但對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制未完全闡明，仍未有轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的臨床檢測(cè)生物標(biāo)志物，所以發(fā)掘肝

2、癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白具有重要意義。
　　腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一項(xiàng)動(dòng)態(tài)復(fù)雜的過程，受環(huán)境影響及多種信號(hào)分子的調(diào)控。惡性腫瘤是一種多基因病同時(shí)也是一種蛋白質(zhì)組疾病，因?yàn)榛蚬δ艿膶?shí)現(xiàn)要靠生物學(xué)功能的執(zhí)行者蛋白分子。所以本研究通過以同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（ isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（2D-LC-MS/MS）的高通量的蛋

3、白組學(xué)對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株的蛋白組學(xué)研究，篩選并鑒定出與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，為后續(xù)肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)警和干預(yù)研究提供新的靶標(biāo)。
　　我們研究選擇三株具有相同遺傳背景不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞MHCC97-L、MHCC97-H及HCCLM3作為分析研究材料，源于同一名肝癌病人的新鮮瘤組織分離，并進(jìn)一步通過裸鼠體內(nèi)肝臟原位移植和體外分篩的方法建立。經(jīng)過收集胞質(zhì)蛋白，脫鹽、濃縮、酶解并用iTRAQ技術(shù)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肽段進(jìn)行檢測(cè)分析，以實(shí)

4、現(xiàn)對(duì)差異蛋白的分離和鑒定。得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)蛋白進(jìn)行注釋。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行GO（Gene ontology）功能分析和通路分析以篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)的目標(biāo)蛋白。并用RT-PCR和Western blot對(duì)其中部分差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。免疫組化分析檢測(cè)從差異表達(dá)蛋白中優(yōu)先選出的目標(biāo)蛋白 PLEC并對(duì)其表達(dá)與肝癌臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　經(jīng)過 iTRAQ標(biāo)記并質(zhì)譜檢測(cè)分析，共發(fā)現(xiàn)鑒定到1170個(gè)

5、蛋白，其中在L/H（MHCC97-L/MHCC9-H）組鑒定發(fā)現(xiàn)47個(gè)差異表達(dá)蛋白，在M/H（HCCLM3/MHCC97-H）組鑒定發(fā)現(xiàn)65個(gè)差異表達(dá)蛋白。生物信息學(xué)分析提示L/H和M/H組差異表達(dá)的蛋白主要參與酶的催化和細(xì)胞間的粘附，并且參與細(xì)胞代謝的過程。應(yīng)用RT-PCR對(duì)差異較大的蛋白進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證，符合質(zhì)譜結(jié)果。應(yīng)用Western blot在蛋白水平上的驗(yàn)證，PLEC在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97-H和HCCLM3中表達(dá)上調(diào)，

6、 SHMT2在HCCLM3中的表達(dá)上調(diào)，LDHA在HCCLM97-H中表達(dá)上調(diào)。在免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)：PLEC在胞膜中的表達(dá)在癌組織中較癌旁組織高，PLEC在胞膜中的表達(dá)量與TNM分期及腫瘤大小呈正相關(guān)相關(guān)（P=0.019，P=0.044）；且Kaplan-Meier生存曲線分析顯示PLEC胞膜中高表達(dá)的患者的生存率低（P=0.016）；Cox回歸分析證明 PLEC在胞膜中的表達(dá)升高是肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示PLEC在細(xì)胞膜中高