探針設(shè)計(jì)原則

1、原位雜交探針大體可分為三類：寡核苷酸探針，cDNA探針，RNA探針。寡核苷酸探針由25bp左右的核苷酸組成，通?？梢杂晒竞铣桑捎谄湫蛄休^短，因此特異性較強(qiáng)，原位雜交時(shí)可以區(qū)分家族基因，同一基因的不同剪切體，cDNA探針長(zhǎng)約500bp左右，可以通過非對(duì)稱PCR擴(kuò)增合成，由于探針式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的結(jié)合不如RNA與RNA結(jié)合強(qiáng)，通常不采用，RNA探針長(zhǎng)約500bp左右，通過體外轉(zhuǎn)錄合成，如果設(shè)計(jì)合理，其特異性

2、是可以得到保證的，其主要缺點(diǎn)是容易被RNAse酶降解。查看原位雜交相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，2000年以前的原位雜交常使用放射性標(biāo)記的寡核苷酸探針，通過膠片曝光來顯色，2000年以后的文獻(xiàn)常使用RNA探針。許多腎臟發(fā)育的文獻(xiàn)雖然有很多原位雜交數(shù)據(jù)，但卻沒有附帶上探針序列或者用于探針模板克隆的引物，通過了解廈門黃老師斑馬魚和昆明毛炳宇爪蟾中原位雜交探針設(shè)計(jì)方法，我們可以采用RNA探針。文獻(xiàn)中很難找到關(guān)于RNA探針設(shè)計(jì)的原則，有的文獻(xiàn)報(bào)道直接用cDN

3、A合成RNA探針。借鑒爪蟾中原位雜交探針設(shè)計(jì)流程，以小鼠FGF10的探針設(shè)計(jì)為例進(jìn)行介紹。1.在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載該FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全長(zhǎng)在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，比對(duì)數(shù)據(jù)庫選擇mousegenometran，比對(duì)程序選擇somewhatsimilarsequence。ZebrafishseqRNAs得出的比對(duì)結(jié)果中有一幅圖譜，顯示比對(duì)序列與數(shù)據(jù)庫中序列的相似性，探3421aatctctagaag

4、aactaggtatctttttttacttttattttaaaataataattatacctg3481acacatgaccatggaccacccacaaccaaaattaaatgtttggggagacaaactatagta3541ttcagtgacaagggtaacagcaaatagtgcagacgttggattcttatttcactttgccat3601ttagattactaaagagactatgtgtaaacagtcatcatta

5、tagtactcaagacattaaac3661agcttctagcaaaatgtatcaaagcttgcagagtccaaaaatagaaaacatctttccccc3721tctcccaccctacatttccccctgtatgcatcctaacagagat底紋標(biāo)注的為引物序底紋標(biāo)注的為引物序列3.將設(shè)計(jì)好的探針序列在UCSC上再次比對(duì)分析，genome選擇mouse，querytype選擇translatedRNA，點(diǎn)擊submi