污泥厭氧消化過程中乙酸累積的微生態(tài)機(jī)理研究.pdf

1、污泥厭氧消化過程中會產(chǎn)生許多中間產(chǎn)物,主要是短鏈有機(jī)酸類。其中,乙酸是主要的中間產(chǎn)物之一,也是有機(jī)化工行業(yè)的重要生產(chǎn)原料。通過厭氧消化,將污泥的有機(jī)成分盡可能多地轉(zhuǎn)化成乙酸,再通過耦合系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為高附加值生物化學(xué)品,不僅可使污泥獲得穩(wěn)定化、無害化處理,而且也可使其中的有機(jī)成分得到更好的利用,這是實(shí)現(xiàn)資源化再利用的一條新途徑。近年來,混合培養(yǎng)生物技術(shù)已經(jīng)成為一個非常有前景的發(fā)展方向。與傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法通過篩選高效微生物或基因改造的思路不同,混

2、合培養(yǎng)生物技術(shù)運(yùn)用的是生態(tài)學(xué)的觀點(diǎn),通過選擇壓力對微生物菌群進(jìn)行調(diào)控。在產(chǎn)酸反應(yīng)器中,為了取得最佳的產(chǎn)酸效果,產(chǎn)甲烷抑制劑就是一種常用的選擇壓力。它可以在不影響產(chǎn)酸微生物的同時,使短鏈有機(jī)酸等中間代謝產(chǎn)物不被產(chǎn)甲烷菌消耗。
　　 本論文以市政污泥為模式底物,利用環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù),在種群和群落水平上研究了產(chǎn)甲烷抑制狀態(tài)下污泥厭氧消化過程中碳流方向、確定了菌群結(jié)構(gòu)與乙酸累積之間的關(guān)系、闡明了各菌群對乙酸累積的貢獻(xiàn)、回答了乙酸

3、的累積是如何通過菌群競爭機(jī)制來控制等問題,為污泥厭氧消化制備乙酸奠定了理論基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:
　　 1.建立了同型乙酸菌免培養(yǎng)的快速定量方法
　　 已報道的同型乙酸菌的引物特異性不高,經(jīng)克隆文庫后發(fā)現(xiàn),大約有55％的克隆并非來自真正的同型乙酸菌,而歸屬于硫酸鹽還原菌等非同型乙酸菌。根據(jù)FTHFS基因數(shù)據(jù)庫重新設(shè)計的引物,經(jīng)過純菌驗(yàn)證,克隆文庫,溶解度曲線等評價后證實(shí)其特異性能夠滿足定量同型乙酸菌的特異性要求。該方

4、法的檢測限為500拷貝/反應(yīng),相當(dāng)于104個拷貝/g干重。對實(shí)際環(huán)境樣品定量后發(fā)現(xiàn),同型乙酸菌在自然界的數(shù)量為105-107個/g干重,占總細(xì)菌數(shù)量的0.6％-0.9％,表明同型乙酸菌在厭氧生境中的豐度不高。
　　 2.產(chǎn)甲烷抑制劑對污泥厭氧發(fā)酵各階段的毒性研究
　　 對兩種經(jīng)典的產(chǎn)甲烷抑制劑BES和氯仿作用于污泥厭氧發(fā)酵不同階段(發(fā)酵產(chǎn)酸,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸,食氫產(chǎn)甲烷和食乙酸產(chǎn)甲烷)的抑制濃度范圍和抑制機(jī)理進(jìn)行了較為細(xì)致的評

5、估后發(fā)現(xiàn):食氫產(chǎn)甲烷反應(yīng)的毒性閾值較高,BES和CHCl3針對其的半抑制濃度(IC50)分別為8.7 mM和0.009％,而食乙酸產(chǎn)甲烷的IC50分別為5.8 mM和0.006％。BES和CHCl3對產(chǎn)酸發(fā)酵和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸過程的抑制也機(jī)理不同。以葡萄糖和VFA作為底物時,氯仿處理污泥的產(chǎn)酸效率和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸活性均有明顯下降,而BES處理組則僅在高濃度時呈現(xiàn)出輕微的熱力學(xué)抑制。兼顧抑制產(chǎn)甲烷效果和產(chǎn)酸效率,最適產(chǎn)甲烷抑制劑濃度分別為50 mM

6、 BES和0.05％CHCl3。
　　 3.產(chǎn)甲烷抑制劑對乙酸消耗微生物群落的實(shí)際效果
　　 T-RFLP和Real-time PCR的結(jié)果顯示,BES和CHCl3不僅抑制了系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷活性,而且對產(chǎn)甲烷種群的數(shù)量和多樣性都有影響。食乙酸產(chǎn)甲烷菌Methanosaetaceae的敏感程度比食氫產(chǎn)甲烷菌Methanobacteriales和Methanomicrobiales高得多。在產(chǎn)甲烷抑制狀態(tài)下,其部分生態(tài)位逐漸被食

7、氫產(chǎn)甲烷菌所占據(jù)。由此推斷,在較低的抑制濃度下,盡管食乙酸產(chǎn)甲烷過程被抑制,乙酸也并不一定會積累。乙酸可能通過乙酸氧化途徑首先分解為H2和CO2,隨后再由食氫產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)化成甲烷。
　　 4.產(chǎn)甲烷抑制狀態(tài)下發(fā)酵產(chǎn)酸菌群的演替特征
　　 細(xì)菌群落指紋的多元統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,產(chǎn)甲烷抑制劑不僅影響產(chǎn)甲烷菌群落,還直接或間接地影響了發(fā)酵產(chǎn)酸菌群。在氯仿抑制實(shí)驗(yàn)中,低G+C含量的革蘭氏陽性菌(Clostridiales),高G+C

8、含量的放線菌(Actinomycetes)以及綠色非硫細(xì)菌(Chloroflex)變?yōu)閮?yōu)勢種群。在BES抑制實(shí)驗(yàn)中,耗氫細(xì)菌Moorella sp.和Geobacter hydrogenophilus推動了群落的演替。由于高濃度的非離解性有機(jī)酸存在,革蘭氏陰性菌Bacteroidetes和Synergistes在兩種抑制模型下的豐度都顯著降低。值得注意的是,仍有超過一半的水解發(fā)酵細(xì)菌對甲烷抑制劑并不敏感,它們與環(huán)境變量的相關(guān)系數(shù)t值均小

9、于0.15。
　　 5.二次發(fā)酵產(chǎn)乙酸細(xì)菌在產(chǎn)甲烷抑制狀態(tài)下的響應(yīng)機(jī)制
　　 氯仿不僅抑制產(chǎn)甲烷菌,對同型乙酸菌也有強(qiáng)烈的抑制作用。培養(yǎng)終了,同型乙酸菌數(shù)量從1.0×108 mL-1減少至3.0×106 mL-1,下降了將近30倍。而在BES抑制模型中,適宜的熱力學(xué)狀態(tài)(AG＜20至-24 kJ mol)和fhs基因拷貝數(shù)的上升(1.5倍,P=0.02)均顯示,同型產(chǎn)乙酸途徑在產(chǎn)甲烷抑制狀態(tài)下對乙酸的累積起著非常重要的作

10、用。產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸過程方面,兩個抑制組中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌數(shù)量均有不同程度的下降。氯仿培養(yǎng)物中,丙酸降解菌(SPOB)和丁酸降解菌(SPOB)細(xì)胞數(shù)比未抑制對照中分別低了13.3和7.9倍(P＜0.001)。而BES處理樣品的SPOB和SBOB的數(shù)量僅有輕微減少(分別下降1.5和2.0倍,P=0.02),同時AG也接近于熱力學(xué)平衡狀態(tài)(AG≈0 kJ/mol)。
　　 6.產(chǎn)甲烷抑制狀態(tài)下有機(jī)碳流和碳平衡分析
　　 通過穩(wěn)定性同位

11、素和放射性同位素進(jìn)行碳流分析后發(fā)現(xiàn),未抑制污泥發(fā)酵樣品的表觀分餾因子αapp獅在1.00-1.01之間,表明乙酸發(fā)酵是污泥產(chǎn)甲烷的主要途徑。而當(dāng)加入較低濃度產(chǎn)甲烷抑制劑后,αapp增加到1.03-1.04之間,產(chǎn)甲烷途徑開始向H2/CO2還原過渡。碳平衡分析和[U-14C]葡萄糖降解實(shí)驗(yàn)證明,同型乙酸菌和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌在產(chǎn)甲烷抑制狀態(tài)下可以通過種間氫轉(zhuǎn)移重新建立互營共生關(guān)系。對[2-14C]乙酸降解過程進(jìn)行的碳流分析則發(fā)現(xiàn),在H2分壓較低