質粒抽提原理及詳細操作步驟

1、質粒抽提質粒抽提實驗室必備技能之一實驗室必備技能之一質粒質粒存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環(huán)狀DNA分子。質粒抽提粒抽提從細菌中分離質粒DNA的方法包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質粒DNA。采用強堿液、加熱或溶菌酶（主要針對革蘭氏陽性細菌）可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和TritonX100（一般很少使用）可使細胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton

2、X100處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA）的兩條鏈不會相互分開。當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，

3、重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。質粒抽提最常用的方法是堿裂解法，它具有得率高、適用面廣、快速和純度高等特點。當然，堿裂解法也有缺陷：容易導致不可逆的變性。要降低不可逆的變性，就要控制好堿裂解的時間。堿裂解法抽提堿裂解法抽提質粒需要用到以下三種溶液粒需要用到以下三種溶液溶液溶液Ⅰ03向離心管中加入250μl溶液Ⅰ（加入RNaseA），吹勻菌沉淀并將懸液轉移至新1.5mLEP管中；注意注意：菌體懸浮不完全會導致裂解不完全

4、，質粒提取量和純度會降低。04向EP管中加入250μl溶液Ⅱ（裂解Buffer），溫和翻轉EP管610次，使菌體充分裂解，液體變得澄清濃稠（開蓋拉絲）；注意注意：所用時間不宜超過5min，以免質粒被破壞；切勿劇烈震蕩；液體未變得澄清，則表明裂解不充分，可適當減少菌體量或增大Buffer使用量；若溶液Ⅱ出現(xiàn)渾濁，可37℃水浴幾分鐘，待液體恢復澄清即可使用。05向EP管中加入350μl溶液Ⅲ，溫和翻轉EP管610次，此時可觀察到管內出現(xiàn)白色