蛋白抽提protocol(全)lyz

1、 Loading Buffer 煮細(xì)胞抽提總蛋白 煮細(xì)胞抽提總蛋白 Protocol1. 細(xì)胞計數(shù)（約 1×106 的細(xì)胞） ，離心收集細(xì)胞（2000rpm×5min） ；2. 預(yù)冷 1×PBS 500ul 重懸洗一次，轉(zhuǎn)至 500ul EP 管（2000rpm×5min） ；3. 去上清，后甩一次，將上清去盡；4. 按每 1×106 的細(xì)胞加 50ul loading buffer 加

2、入 2×loading；5. Vortex 一下，煮 10～15min 一次×2～3 次直至無粘絲；6. 每次煮好將其放于冰上，靜置約 2min，Vortex 一下，再甩一下；7. 三次后用槍吸起，如沒有粘絲，即可；8. 每次上樣約 5ul（50ug/ul 蛋白）RIPA 裂解抽提總蛋白 裂解抽提總蛋白 Protocol1. 細(xì)胞計數(shù)（約 1×107 的細(xì)胞） ，離心收集細(xì)胞（2000rpm×5m

3、in） ；2. 預(yù)冷 1×PBS 1ml 重懸洗 2 次，轉(zhuǎn)至 1.5ml EP 管（2000rpm×5min） ；3. 去上清，后甩一次，將上清去盡；4. 按照如下比例加入裂解試劑：RIPA ： 300ul/1×107 細(xì)胞PMSF ： 3ul(1:100)Cocktail ： 0.3ul(1:1000)5. 吹打均勻，冰上放置 30-40min，中間每 10 分鐘

4、 Vortex 一次；6. 4℃預(yù)冷離心：10000rpm ×10min；7. 收集上清，轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷新 EP 管，即為總蛋白?！緸榱藵饪s蛋白，加 RIPA 的量改為 200ul 或者更低，可稍微延長冰上裂解時間，而 RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不變 】核基質(zhì)蛋白抽提 核基質(zhì)蛋白抽提 Protocol1、 細(xì)胞計數(shù)（約 1×107 的細(xì)胞） ，離心（1100rpm&#

5、215;5min）收集細(xì)胞；2、 用 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸，將細(xì)胞移至 1.5ml EP 管中，1×PBS 洗一遍；3、 加 300ul RIPA/1×107 的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，至冰上 15-30min；RIPA＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）4、 4℃預(yù)冷離心：13000rpm ×10-15min；5、 將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的已 4℃預(yù)冷的 1.5ml EP 管，冰上備用(

6、總蛋白)；6、 用１×PBS 洗管底的 pellet×2 遍；7、 加入 Urea-Lysis buffer 10-15ul 裂解 pellets，vortex 10min；8、 4℃預(yù)冷離心：13000rpm ×10min；用 BufferA 90ul 稀釋，此為核基質(zhì)蛋白。RIPA（PH 8.0）：150mM NaCL1% NP-400.5% DOC0.1% SDS50mM TrisUrea-Lysis

7、 buffer（PH 8.0）： ）：100mM NaH2PO410mM Tris-HCL300mM NaCL8M ureaBuffer A：100mM NaH2PO410mM Tris-HCL300mM NaCL1% Triton X-100cytoplasmic cell fractions were prepared by incubating the cells in icecoldIso-Hi buffer 140 mM Na

8、Cl25 mM Tris [pH 7.4]1.5 mM MgCl2)0.5% Nonidet P-40for 5 min and then subjecting them to low-speed centrifugation to collect the nuclei. Nuclei were incubated inhigh-salt extraction buffer 20 mM HEPES (pH 7.9)25% (v/v) g

9、lycerol 0.5 MNaCl1.5 mM MgCl2 0.2 mM EDTA 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)0.5 mM DTT;for 1 h at 4C. The DNA-particulate fraction was pelleted by microcentrifugation (15,000 rpm), washed once in high-salt buffe

10、r, solubilized in radioimmunoprecipitation assay buffer(RIPA), and sonicated to sheer the DNA. Equal amounts of all fractions were precipitated with trichloroacetic acid, resuspended in protein sample buffer, and separat