植物組織培養(yǎng)實驗室的組成儀器設(shè)備及基本操作

1、植物組織培養(yǎng)實驗室的組成、儀器設(shè)備及基本操作,一、植物組織培養(yǎng)實驗室的結(jié)構(gòu)及設(shè)計要求： 完整的植物組織培養(yǎng)室通常包括洗滌室、化學(xué)實驗室、接種室、培養(yǎng)室、細胞學(xué)實驗室等部分?？梢愿鶕?jù)實際需要和條件進行設(shè)計。 但從功能上至少包括準(zhǔn)備室（化學(xué)實驗室）、接種室以及培養(yǎng)室三部分，并且按順序排列。 在化學(xué)實驗室與接種室之間應(yīng)留有緩沖空間。,第一節(jié) 實驗室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù),（一）準(zhǔn)備室（化學(xué)實驗室）： 1.

2、 主要功能： 用于培養(yǎng)器皿的清洗、干燥、培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌、試管苗的出瓶及整理等工作。,2. 主要儀器設(shè)備及用品： 藥品柜、實驗臺、水槽、超聲波洗滌儀、涼干架、干燥箱、各種玻璃器皿（燒杯、量筒、容量瓶、試劑瓶、三角瓶等）、蒸餾水制造裝置。 天平、移液器、 pH計、水浴鍋、微波爐、電爐、磁力攪拌器、蠕動泵、及培養(yǎng)基分裝用品等、高壓滅菌鍋、 冰箱。,（二）接種室（無菌操作室）： 1、功能：

3、 接種材料的滅菌、接種以及培養(yǎng)物的繼代轉(zhuǎn)接等。 接種室要求保持潔凈，與化學(xué)實驗室之間應(yīng)設(shè)置緩沖室。,,2、儀器設(shè)備及用品： 超凈工作臺、紫外燈、小推車、擱架、磁盤、接種工具（各種鑷子、解剖刀、手術(shù)剪、普通剪刀接種針、酒精燈、手持噴霧器、細菌過濾器等）等。,（三）培養(yǎng)室： 1、功能： 主要用于植物材料的培養(yǎng)。 要求室內(nèi)潔凈并能保持一定的溫度、光照以及濕度，以促進植物材料的生長和分

4、化。,2、儀器設(shè)備及用品： 培養(yǎng)架及燈管、搖床（振蕩器）、空調(diào)、自動定時器、加濕及除濕器、光照培養(yǎng)箱等。,（四）細胞學(xué)實驗室： 1、功能： 主要用于培養(yǎng)材料的顯微觀察及照相等。,2、儀式設(shè)備及用品： 體視顯微鏡、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、配套顯微照相裝置、普通相機或數(shù)碼相機、切片機及配套制片及染色用品等。,體視顯微鏡,,用途：放大倍數(shù)5~80倍主要用于植物形態(tài)分化的觀察、莖尖的切取。,普

5、通光學(xué)顯微鏡,用途：用于植物切片觀察，確定植物的發(fā)育進程，如：不定芽、不定胚的分化過程以及其它器官組織的分化等。,倒置顯微鏡,用途：主要用于細胞、原生質(zhì)體的細胞分裂和細胞團形成的觀察。,（一）洗滌： 1. 普通器皿：采用洗衣粉、洗潔精等中性洗滌劑洗滌。 2. 難清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重鉻酸鉀洗液浸泡，最后清水沖洗，或用超聲波儀清洗。,重鉻酸鉀洗液的配制方法：43g重鉻酸鉀溶于1000ml蒸餾水中，將濃硫酸緩慢

6、倒入重鉻酸鉀溶液中，濃度比例為1：1。,二、實驗室基本操作：,1、器具滅菌：培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子等用品。 （1）干熱滅菌：鋁箔包好后，放于恒溫干燥箱內(nèi)，150 ℃保溫2小時，成本較高。 （2）高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)120 ℃ 15－20分鐘 。 （3）灼燒滅菌：接種時，解剖刀及鑷子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精燈火焰上灼燒殺菌。,（二）滅菌： 滅菌 是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物（包

7、括芽胞），使之呈無菌狀態(tài)。經(jīng)過滅菌的物品稱“無菌物品”。,,2、培養(yǎng)基滅菌： 采用高壓蒸汽滅菌。120℃ 15－20分鐘。 培養(yǎng)基體積越大，滅菌時間越長。,高溫高壓滅菌對培養(yǎng)基成分的影響：　a.pH值普遍下降?！.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。　c.不少培養(yǎng)基顏色加深。　d.體積和濃度有所變化?！.營養(yǎng)成分有時受到破壞。

8、,3、不耐高溫材料的滅菌： 采用過濾滅菌，如IAA、ZT、天然有機添加物等。,4、外植體的表面滅菌： 采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效氯1％的次氯酸鈉（5-30分鐘）、0.1－0.2%的氯化汞（2-15分鐘）等殺菌劑中加入幾滴吐溫－20或80（Tween－20或80）效果較好。,（三）無菌操作： 1、保持接種室的無污染環(huán)境，定期熏蒸或噴霧處理。接種前打開超凈工作臺及紫外燈照射20-30分鐘，關(guān)閉紫外等燈后

9、使氣體散出后開始操作。 2、保持超凈工作臺的潔凈：接種前用70％乙醇擦拭臺面或用噴壺噴霧，操作前，將手和手臂用70％乙醇消毒，所需試驗用品用乙醇擦拭后放入超凈工作臺。,3、點燃酒精燈，進行操作，接種材料前后，灼燒瓶口，工具要灼燒徹底，防止交叉污染。4、保持培養(yǎng)室的潔凈，發(fā)現(xiàn)污染及時挑出，以減少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接種室換拖鞋以保持接種室的潔凈。,第二章 植物組織培養(yǎng)實驗室的組成、儀器設(shè)備及基本操作,

10、第一節(jié) 實驗室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù) 一、植物組織培養(yǎng)實驗室的結(jié)構(gòu)及設(shè)計要求 二、 實驗室基本操作,第二章 植物組織培養(yǎng)實驗室的組 成、儀器設(shè)備及基本操作,第二節(jié) 培養(yǎng)基的組成、配制與滅菌,一、培養(yǎng)基（medium）的組成和作用,通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以下六大類成分，即礦質(zhì)營養(yǎng)、有機成分、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。,培養(yǎng)基的主要指標(biāo)是: 營養(yǎng)成

11、分的濃度 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度,（一）礦質(zhì)營養(yǎng)： 礦質(zhì)營養(yǎng)又稱無機營養(yǎng)，是指植物生長發(fā)育所需要的各種化學(xué)元素。,礦質(zhì)元素的生理作用：（1）組成各種化合物，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；（2）許多酶和附酶的組成部分，參與代謝；（3）維持離子平衡、膠體穩(wěn)定及電荷平衡等電化學(xué)作用；（4）影響形態(tài)發(fā)生和組織、器官的建成等。,根據(jù)植物對元素的吸收量，可以把植物必需元素分為大量元素和微量元素。 國際植物生理

12、學(xué)會規(guī)定植物所需濃度大于0.5 mmol/l的的元素稱為大量元素。低于0.5 mmol/l的元素稱為微量元素。 大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 分別占植物干重的百分?jǐn)?shù)為18％、10％、70％、0.3%、0.07％、0.3%、0.3 ％、0.07%、0.05％。 微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。,1、大量元素： N、P、K、Ca、Mg、S等6種大量元素依靠各種無機鹽提供。

13、 不同植物種類和不同試驗?zāi)康膶υ氐氖褂昧恳蟛煌?，需?jīng)試驗確定。 目前已選擇出多種培養(yǎng)基配方用于植物組織培養(yǎng)。其中以MS應(yīng)用最廣泛。 以MS為例6中礦質(zhì)元素分別由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO47H2O、CaCl24H2O提供。,,大量元素中的氮通常采用硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但銨態(tài)氮濃度過高會對有些植物的培養(yǎng)物造成傷害，不適宜使用過高的濃度，可以用谷氨酸、絲氨酸等來代替。,2、微量元素： 植物組織的對其需要量

14、極少，過多會產(chǎn)生毒害，如造成蛋白質(zhì)變性、酶失活,代謝障礙等。 各種微量元素均具有特定的生理功能，如硼與蛋白質(zhì)的合成及糖類的運輸有關(guān)；銅能促進離體根的形成；錳參與植物的光合作用和呼吸作用；鉬為氮素代謝的重要元素。,微量元素中，鐵的用量較大，它對葉綠素的合成起重要作用，由于在較高pH下，F(xiàn)eCl3極易形成Fe（OH）3沉淀，難以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二鈉鹽與硫酸亞鐵形成的螯合物，并且單獨配制。,（二）有機成分： 主要包括各種

15、維生素和氨基酸 常用的維生素：硫胺素（VB1）、吡哆醇（VB6）、煙酸（VB3）、泛酸鈣（VB5）、生物素、鈷胺素（VB12）、葉酸等。 常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。 有時添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，為牛乳經(jīng)酶法加工的水解產(chǎn)物，含有20種氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L, 通常用于原生質(zhì)體等培養(yǎng)。 此外肌醇是另外一種重要的有機成分，在維持離子平衡，

16、糖類的轉(zhuǎn)化中起重要作用，此外還參與磷脂代謝及等生理作用。它可以促進愈傷組織的形成，不定芽、不定胚的分化。,（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)： 植物激素是植物代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能直接影響植物細胞的分化、分裂以及影響植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動。 在植物組織培養(yǎng)中，主要通過植物激素及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對離體的組織、器官的形態(tài)發(fā)生進行調(diào)控。包括誘導(dǎo)細胞分裂、愈傷組織的生長、根芽的分化以及體細胞胚胎發(fā)生等

17、。,常用的植物激素及生長調(diào)節(jié)物涉及五大類植物激素：1、生長素類：2、細胞分裂類：3、赤霉素類：4、脫落酸：5、多胺6、乙烯：,1、生長素類： 組織培養(yǎng)中的功能是：促進細胞伸長生長和細胞分裂，誘導(dǎo)形成愈傷組織，促進生根。 常用的有NAA、IAA、IBA、2,4－D等。,2、細胞分裂素類： 功能：誘導(dǎo)芽的分化、促進側(cè)芽萌發(fā)；促進細胞分裂和擴大，促進莖增粗，抑制莖伸長；延緩衰老。 常用細胞分裂素有BA、KT、ZT

18、、2ip等。,此外近年來發(fā)現(xiàn)苯基脲衍生物具有非常高的細胞分裂素活性，在多種植物上應(yīng)用。 如TDZ，CPPU，4－PU等。,3、赤霉素類： 主要具有誘導(dǎo)莖的細胞伸長，對根無效；對形成層細胞分化有影響，與生長素協(xié)同作用；可以誘導(dǎo)離體成花；打破休眠等功能。 常用GA3、GA4等。,4、脫落酸（ABA）： 促進休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng)中較少使用，主要用于種質(zhì)資源的離體保存。,5、乙烯： 主要促進衰老和脫落，高濃度易形態(tài)變

19、化。,（四）碳源： 碳源主要為細胞提供合成新化合物的骨架，為細胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持一定的滲透壓。 常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在10－50g/L，此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物組織培養(yǎng)。,（五）瓊脂： 瓊脂作為固化劑用于組織培養(yǎng)中，起支持植物的作用，不提供營養(yǎng)，為海藻中提取的一種高分子化合物，僅溶于熱水（90 oC以上），成為凝膠，冷卻后（40 oC以下）即凝固

20、為凝膠。 瓊脂的用量通常在4～10g/L。,（六）有機附加物： 1、椰子汁： 用量為100～200g/L。 2、香蕉泥： 使用量為150～200g/L。 3、蘋果汁、番茄汁等。,（七）其他成分： 1、活性炭：使用量為0 .2-1%。 2、抗生素：常用青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20mg/L。 3、抑制酚類物質(zhì)：抗壞血酸. 4、生長抑制劑： 常用矮壯素、比

21、久（B9）、多效唑（pp333） 、三碘苯甲酸、根皮酚等.,二、培養(yǎng)基的類型：1、高鹽濃度培養(yǎng)基：MS、B5、SH等。 適用于多數(shù)營養(yǎng)需求量較大的植物。2、低鹽培養(yǎng)基：WPM、 White、 Nitsh等。 適用于木本植物的培養(yǎng)。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,表3 N6培養(yǎng)基的組成和配方,三、培養(yǎng)基母液及激素母液的配制： 由于培養(yǎng)基中元素用量少，種類多，因此每次稱量繁瑣，因此通常將各種營

22、養(yǎng)成分配制成母液保存。 大量元素 微量元素 有機營養(yǎng) 激素,1、器皿和用具的準(zhǔn)備 儀器包括萬分之一天平，百分之一天平，pH計 用品包括不同型號的燒杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、試劑瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）、滴

23、管、玻璃棒、試管、各種規(guī)格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、培養(yǎng)基分裝器，漏斗、稱量紙、標(biāo)簽紙、不同范圍pH試紙、鉛筆等。 玻璃器皿用前清洗干凈。,2、藥品及蒸餾水準(zhǔn)備： 藥品采用分析純或化學(xué)純試劑。 水利用蒸餾水或去離子水。,3、母液配制： （1）配制母液原則：,相同類型的試劑混合；易形成沉淀的藥品分開；母液濃度要適宜；用量要認真計算和核對； 藥品要準(zhǔn)確稱量。,（2）MS培養(yǎng)基母液的配制：

24、 MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成四種母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe鹽（100倍）、有機物（100倍）。 配置前先進行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配制體積計算母液試劑用量，然后稱取藥品，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，鐵鹽和有機物用萬分之一天平稱量。,（3）激素母液的配制： 根據(jù)各種激素的使用濃度配制適宜的母液，用萬分之一天平稱取激素，溶劑溶解后加水定容。

25、 生長素類、赤霉素類及脫落酸等用95％乙醇溶解；細胞分裂素類用1N HCl或1N NaOH溶解。 通常激素母液濃度生長素類為0.1~0.5 mg/ml, 細胞分裂素母液濃度為0.2~1.0 mg/ml.,四、培養(yǎng)基的配制：,量取母液：營養(yǎng)元素和激素。稱量蔗糖、瓊脂，放入600ml左右蒸餾水的鍋內(nèi)，電路上加熱，使瓊脂溶化。加入母液，混合均勻，調(diào)整pH值。,四、培養(yǎng)基的配制：,量取母液：營養(yǎng)元素和激素。稱量蔗糖、

26、瓊脂，放入600ml左右蒸餾水的鍋內(nèi)，電路上加熱，使瓊脂溶化。加入母液，混合均勻，調(diào)整pH值。,封口：用4－6層稱量紙或瓶蓋封口，之后滅菌備用。分裝入瓶，每瓶40－50ml。,五、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）：1、加熱： 滅菌前檢查滅菌鍋內(nèi)水量是否充足，然后將培養(yǎng)基放于滅菌鍋內(nèi)，改好蓋，關(guān)閉放氣閥，打開電源，加熱升溫。2、排氣： 當(dāng)溫度升至0.5kg/cm(100 0C)時，打開放氣閥徹底排出鍋內(nèi)冷空氣。然

27、后關(guān)閉放氣閥，促使壓力繼續(xù)上升。,3、溫度控制： 當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至1.1kg/cm2(121oC)時，計時15－20分鐘，計時結(jié)束后，關(guān)閉電源。4、出鍋： 當(dāng)滅菌鍋自然冷卻后，取出培養(yǎng)基，放置于接種室備用。,1、先天下之憂而憂；后天下之樂而樂?！吨傺汀　?、捐軀赴國難，視死忽如歸?！苤病　?、近鄉(xiāng)情更切，不敢問來人。——宋之問　　4、氣蒸云夢澤；波撼岳陽城。——孟浩然　　5、中夜四五嘆，常為大國憂

28、?！畎住　?、國恥未雪，何由成名？——李白　　7、當(dāng)須徇忠義，身死報國恩?！钕Ｖ佟　?、科學(xué)雖沒有國界，但是學(xué)者卻有他自己的國家?！退沟隆　?、虛榮的人注視著自己的名字，光榮的人注視著祖國的事業(yè)?！R蒂　　10、愛國主義就是千百年來固定下來的對自己的祖國的一種最深厚的感情?！袑帯　?1、利于國者愛之，害于國者惡之?！虌搿　?2、常思奮不顧身，而殉國家之急?！抉R遷　　13、愛國如饑渴?！喙獭?/p>

29、　14、一身報國有萬死，雙鬢向人無再青?！懹巍　?5、死去原知萬事空，但悲不見九州同。王師北定中原日，家祭無忘告乃翁。——陸游　　16、人生自古誰無死，留取丹心照汗青?！奶煜椤　?7、天下興亡，匹夫有責(zé)?！櫻孜洹　?8、南北驅(qū)馳報主情，江花邊草笑平生。一年三百六十日，都是橫戈馬上行?！堇^光　　19、瞞人之事弗為，害人之心弗存，有益國家之事雖死弗避。——呂坤　　20、各出所學(xué)，各盡所知，使國家富強不受外侮，足以

30、自立于地球之上?！蔡煊印　?1、做人最大的事情是什么呢？就是要知道怎樣愛國?！獙O中山　　22、我們愛我們的民族，這是我們自信心的泉源?！芏鱽怼　?3、為中華之崛起而讀書?！芏鱽怼　?4、以身許國，何事不敢為？——岳飛　　25、夜視太白收光芒，報國欲死無戰(zhàn)場！——陸游　　26、位卑不敢忘憂國。——陸游　　27、寄意寒星荃不察，我以我血薦軒轅?！斞浮　?8、中國自古以來，就有埋頭苦干的人，就有拼命硬干的人，

31、就有為民請命的人，就有舍身求法的人?！麄兪侵袊募沽??！斞浮　?9、惟有民魂是值得寶貴的，惟有它發(fā)揚起來，中國人才有真進步?！斞浮　?0、我們中華民族有同自己的敵人血戰(zhàn)到底的氣概，有在自力更生的基礎(chǔ)上光復(fù)舊物的決心，有自立于世界民族之林的能力?！珴蓶|　　31、與其忍辱生，毋寧報國死?！蜗隳　?2、錦繡河山收拾好，萬民盡作主人翁?！斓?3、人民不僅有權(quán)愛國，而且愛國是個義務(wù)，是一種光榮?！焯亓ⅰ　?/p>

32、34、愛國的主要方法，就是要愛自己所從事的事業(yè)?！x覺哉　　35、中國是古老的民族，也是勇敢的民族。中華民族有兩大優(yōu)點：勇敢，勤勞。這樣的民族多么可愛，我們愛我們民族（當(dāng)然其他民族也有他們可愛之處，我們決不忽視這一點），這是我們自信心的泉源。——周恩來　　36、真正的愛國者是愛人類的，愛國決不是排外。——馬鐵丁　　37、愛國主義就是千百年來鞏固起來的對自己的祖國的一種最深厚的感情?！袑帯　?8、必須經(jīng)過祖國這一層樓，然后更