專題微生物培養(yǎng)與應(yīng)用

1、專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,一、微生物在現(xiàn)代生物技術(shù)中有哪些應(yīng)用？,提取工具酶：提供運(yùn)載體：作為受體細(xì)胞：提供目的基因：構(gòu)建基因文庫：發(fā)酵工程的工程菌：,限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶等,細(xì)菌質(zhì)粒、λ噬菌體、動植物病毒等,培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因微生物,抗蟲基因、抗病基因等,直接分離目的基因構(gòu)建基因組文庫、逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA文庫,生產(chǎn)味精的谷氨酸棒狀桿菌、生產(chǎn)酸奶的乳酸桿菌等,㈠培養(yǎng)基

2、 P2841.五大基本成分： 各種培養(yǎng)基一般都含有碳源、氮源、生長因子、水和無機(jī)鹽，此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。,1、提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件2、確保其它微生物無法混入,二、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物條件,——培養(yǎng)基,——無菌技術(shù),培養(yǎng)細(xì)菌常用的培養(yǎng)基 ——牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,①按化學(xué)組成不同劃分：合成培養(yǎng)基/天然培養(yǎng)基,2.培養(yǎng)基的種類,

3、擴(kuò)大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn),含瓊脂，用于菌落鑒定、分離和計(jì)數(shù),觀察微生物運(yùn)動、保存菌種,固體培養(yǎng)基：觀察菌落、鑒定、分離和計(jì)數(shù)劃線法、稀釋涂布分離法,半固體培養(yǎng)基：,無動力 有動力(彌散),,,觀察微生物運(yùn)動、保存菌種,液體培養(yǎng)基,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,③按用途不同劃分,鑒別培養(yǎng)基,,,選擇培養(yǎng)基,可在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進(jìn)所需要的微生物的生長。,鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，

4、在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。,鑒別培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。,在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍(lán)，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌： 如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。,大腸桿菌在伊紅美蘭培養(yǎng)基上生長,利用拓印法選擇出缺少抗氨芐青霉素能力的工程菌。

5、,選擇培養(yǎng)基,以下選擇培養(yǎng)基可以分離哪些微生物？,加入青霉素的培養(yǎng)基 殺死細(xì)菌、放線菌，分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基 殺死多種微生物，分離出金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基 分離出自生固氮菌（非固氮菌因缺少氮源被淘汰）不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基 分離出自養(yǎng)型微生物（異養(yǎng)微生物因缺少有機(jī)物被淘汰）加入抗生素的培養(yǎng)基

6、 利用抗生素抗性基因作標(biāo)記基因，選擇分離出導(dǎo)入目的基因的工程菌,分解纖維素的微生物的分離（1）實(shí)驗(yàn)原理,纖維素 + 染料→紅色復(fù)合物（纖維素 + ）+ 剛果紅染料 → 培養(yǎng)基中出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的,剛果紅,纖維素酶,透明圈,（2）實(shí)驗(yàn)流程,土壤取樣 制備選擇培養(yǎng) ↓挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 將樣品涂布到鑒別

7、 的培養(yǎng)基上,纖維素分解菌,,,,梯度稀釋,,不同菌落的透明圈大小不同可以說明什么問題？,分解纖維素的微生物的分離,透明圈的應(yīng)用（1）篩選具有某種特定功能（如分泌

8、某種酶）的微生物（目的菌）（2）基因工程中表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因的檢測與鑒定（3）細(xì)菌抗藥性的篩選,不同菌落的透明圈大小不同可以說明微生物體分解纖維素酶能力的大小。,例：通過選擇培養(yǎng)基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。在缺乏氮源的培養(yǎng)基上大部分微生物無法生長；在培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細(xì)菌和放線菌；在培養(yǎng)基中加入10%酚可以抑制細(xì)菌和霉菌。利用上述方法能從混雜的微生物群體中分別分離出 A.大腸桿菌 B.霉菌

9、 （ ）C.放線菌 D.固氮細(xì)菌 多選,DBC,（二）無菌技術(shù),1、實(shí)驗(yàn)室常用的消毒和滅菌方法：,⑴消毒： 使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。,煮沸法：100℃5-6min殺死微生物細(xì)胞和部分芽孢巴氏消毒法：70-75℃煮30min，殺死牛奶中微生物化學(xué)藥劑消毒法：酒精、氯氣,（2）灼燒滅菌——如接種環(huán)等： 接種時(shí)，用于接種工具或其他金屬用

10、具滅菌。直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒可以迅速徹底滅菌,（3）干熱滅菌： 用于耐高溫需干燥物品（玻璃器皿、金屬用具）,（4）高壓蒸汽滅菌——培養(yǎng)基： 用于培養(yǎng)基等物品的滅菌,2、無菌操作： 操作空間、操作者、培養(yǎng)器皿、接種用具、培養(yǎng)基,討論：1.為什么在實(shí)驗(yàn)過程要使用無菌技術(shù)？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管

11、、燒瓶和吸管（3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,⑴防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染；⑵避免操作者自身被微生物感染。,（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,三、純化實(shí)驗(yàn)操作,（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,1、計(jì)算2、稱量3、溶化4、滅菌5、倒平板,倒平板注意事項(xiàng)：①溫度：50℃左右②操作在酒精燈火焰周圍③冷凝后平板倒置,討論,1. 平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面

12、的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,(二）純化大腸桿菌,⑴平板劃線法: 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次劃線后,可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.,微生物的接種技術(shù),,,,,,,劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌

13、的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。,單菌落,,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物； 每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目

14、逐漸減少，以便得到菌落。 劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,討論,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的

15、菌落。,討論,⑵稀釋涂布平板法（稀釋度和稀釋濃度）,稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋程度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)，以形成標(biāo)準(zhǔn)菌落。,接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基(空白對照）都放入37恒溫箱中，培養(yǎng)12h和24h后，分別觀察并記錄結(jié)果,（三）微生物數(shù)量測定1、測定土壤中的細(xì)菌數(shù)，一般選用104、105、106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)時(shí)，每一濃度至少涂布3個平板，以增強(qiáng)實(shí)

16、驗(yàn)的說服力和準(zhǔn)確性。 當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品大約含有多少個活菌。,（2）計(jì)數(shù)規(guī)則①計(jì)算方法：每克樣品中的菌落數(shù)=（C÷V）×M C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù) V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積（mL） M代表稀釋倍數(shù)②設(shè)置對照：排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的

17、影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)若某兩個或多個稀釋濃度下獲得的菌落數(shù)均符合條件時(shí)，要看兩者菌落數(shù)的比值，若小于2，則取兩者的平均值；若大于2，則取較小值,1.關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽 D.無機(jī)氮源也能提供能量,D,3. 09（安徽）下列是關(guān)于“檢測土壤中細(xì)菌總數(shù)”實(shí)驗(yàn)操作的敘述，其中錯誤的

18、是A.用蒸餾水配制牛肉膏蛋白膝培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B.取104、105 、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1ml，分別涂布于各組平板上C．將實(shí)驗(yàn)組和對照組平板倒置，370C恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)D．確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實(shí)驗(yàn)組平板進(jìn)行計(jì)數(shù),D,應(yīng)該選擇菌落數(shù)在30—300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),4.09（重慶）下列有關(guān)大腸桿菌的敘述，正確的是 A.大腸桿菌以復(fù)制方式進(jìn)行繁殖，其擬核是一個環(huán)狀DNA分

19、子 B.在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上，大腸桿菌首先利用乳糖作碳源 C.用大腸桿菌工程菌生產(chǎn)干擾素時(shí)．應(yīng)及時(shí)添加核酸等生長因子 D.處于對數(shù)期（生長快、繁殖快時(shí)期）的大腸桿菌．常作為生產(chǎn)用的菌種和科研的材料,D,,,,應(yīng)該添加氨基酸,5.寧夏09（15分） （1）在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮營養(yǎng)條件外，還要考慮______、______和滲透壓等條件。由于該細(xì)菌具有體積小、結(jié)構(gòu)簡單、變異類型容易選擇、______、____

20、__ 等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為遺傳學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料。 （2）在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行________（消毒、滅菌）；操作者的雙手需要進(jìn)行清洗和______；靜止空氣中的細(xì)菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質(zhì)變性，還能__________。 （3）若用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)大腸桿菌活菌的個數(shù)，要想使所得估計(jì)值更接近實(shí)際值，除應(yīng)嚴(yán)格操作、多次重復(fù)外，還應(yīng)保證待測樣品稀釋的_______

21、。,生活周期短,溫度 酸堿度,易培養(yǎng),,,,滅菌,消毒,損傷DNA結(jié)構(gòu),比例合適,（4）通常，對獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對細(xì)菌進(jìn)行初步的____________。 （5）培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，在接種前需要檢測培養(yǎng)基是否被污染。對于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測方法是 （6）若用大腸桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過_______處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴(kuò)散。,鑒定,將未接種的培養(yǎng)基在適宜的

22、溫度下放置適宜的時(shí)間,觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。,滅菌,6. 09（10分）（全國理綜2）　　利用微生物分解玉米淀粉生產(chǎn)糖漿，具有廣闊的應(yīng)用前景。但現(xiàn)有野生菌株對淀粉的轉(zhuǎn)化效率低，某同學(xué)嘗試對其進(jìn)行改造，以獲得高效菌株?！　。?）實(shí)驗(yàn)步驟：　　①配置________（固體、半固體、液體）培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的碳源應(yīng)為________?！　、趯____________接入已滅菌的培養(yǎng)基平板上?！　、哿⒓从眠m當(dāng)劑量的紫外線照射，其

23、目的是___________________。,固體,玉米淀粉,野生菌株,對野生菌株進(jìn)行誘變,④菌落形成后，加入碘液，觀察菌落周圍培養(yǎng)基的顏色變化和變化范圍的大小。周圍出現(xiàn)_______________ 現(xiàn)象的菌落即為初選菌落，經(jīng)分離、純化后即可達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康??！　。?）若已得到二株變異菌株I和II，其淀粉轉(zhuǎn)化率較高，經(jīng)測定菌株I淀粉酶的催化活性高，菌株II的淀粉酶蛋白含量高，經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變發(fā)生在淀粉酶基因的編

24、碼區(qū)或非編碼區(qū)，可推測出菌株I的突變發(fā)生在________區(qū)，菌株II的突變發(fā)生在_________區(qū)。,（透明圈）淺色范圍大,編碼,非編碼,表達(dá)的蛋白質(zhì)多。,,7.右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是：（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入：,自養(yǎng)型微生物,含碳有機(jī)物,⑶若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng) 。⑷表中營養(yǎng)成

25、分共有 類⑸不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后分裝前，要進(jìn)行的是 。,固氮微生物,3,調(diào)整pH,（6）右表中各成分重量確定的原則是：（7）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應(yīng)該增加的成分是：,依微生物的生長需要確定,瓊脂（或凝固劑）,8.（09上海卷）16.在光照下，將等細(xì)胞數(shù)量的衣藻和大腸桿菌分別接種到只含無機(jī)鹽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，結(jié)果是（虛線和實(shí)線分別表示大腸桿菌和衣藻的生長曲線）,C,9.（07寧夏高考）某小組同學(xué)為了調(diào)

26、查湖水中細(xì)菌的污染情況而進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)包括制備培養(yǎng)基、滅菌、接種及培養(yǎng)、菌落觀察計(jì)數(shù)。請回答與此實(shí)驗(yàn)相關(guān)的問題。（1）培養(yǎng)基中含有蛋白胨、淀粉分別為細(xì)菌培養(yǎng)提供了______和_________。除此之外，培養(yǎng)基還必須含有的基本成分是_______和_________。（2）對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，應(yīng)該采用的方法是________________。（3）為了盡快觀察到細(xì)菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)將接種了湖水樣品的平板置于__________

27、_中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度設(shè)定在37℃。要使該實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果可靠，還應(yīng)該同時(shí)在另一平板上接種_________作為對照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（4）培養(yǎng)20小時(shí)后，觀察到平板上有形態(tài)和顏色不同的菌落，這說明湖水樣品中有_____種細(xì)菌。一般說來，菌落總數(shù)越多，湖水遭受細(xì)菌污染的程度越______。（5）如果提高培養(yǎng)基中NaCl的濃度，可以用于篩選耐_______細(xì)菌，這種培養(yǎng)基被稱為________________。,氮源,碳源,無機(jī)鹽,水,高壓蒸汽滅菌

28、,恒溫培養(yǎng)箱,無菌水,多,高,鹽,選擇性培養(yǎng)基,10.（07山東高考）乙醇等"綠色能源"的開發(fā)備受世界關(guān)注。利用玉米秸稈生產(chǎn)燃料酒精的大致流程為：（1）玉米秸稈預(yù)處理后，因該選用__________酶進(jìn)行水解，使之轉(zhuǎn)化為發(fā)酵所需的葡萄糖。（2）從以下哪些微生物中可以提取上述酶？________（多選）A.釀制果醋的醋酸菌 B.生長在腐木上的霉菌C.制作酸奶的乳酸菌 D.生產(chǎn)味

29、精的谷氨酸棒狀桿菌E.反芻動物瘤胃中生存的某些微生物（3）若從土壤中分離生產(chǎn)這種酶的微生物，所需要的培養(yǎng)基為__________（按功能分），培養(yǎng)基中的碳源為___________ 。（4）發(fā)酵階段需要的菌種是_________，生產(chǎn)酒精是要控制的必要條件是________ 。,纖維素,B、E,選擇培養(yǎng)基,纖維素,無氧（密封、密閉）,酵母菌,遺傳工程克隆（分子水平）,細(xì)胞克?。?屬于細(xì)胞水平上的克隆，是由單個細(xì)胞

30、獲得細(xì)胞群體的過程。 把一個單細(xì)胞從群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之繁衍成一個新的細(xì)胞群體的技術(shù)，叫做克隆培養(yǎng)法或細(xì)胞克隆。 例如由一個細(xì)菌通過二分裂繁殖出千上萬個和它一模一樣的細(xì)菌群——菌落的過程也稱為微生物克隆。 再如由B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞通過細(xì)胞分裂形成雜交瘤細(xì)胞系的過程,細(xì)胞水平克隆,,Thank you,拯畏怖汾關(guān)爐烹霉躲渠早膘岸緬蘭輛坐蔬光膊列板哮瞥疹傻俘源拯割宜