化妝品安全技術規(guī)范

1、1附件2細菌回復突變試驗BacterialReverseMutationAssay1范圍本規(guī)范確定了細菌回復突變試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。2定義2.1回復突變reversemutation細菌在化學致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。2.2基因突變genemutation在化學致突變物作用下細胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。2.3堿基置換突變basesubs

2、titutionmutation引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。堿基置換有轉換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。轉換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌呤被另一嘌呤所代替。顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌呤被另一嘧啶所代替。2.4移碼突變frameshiftmutation引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。2.5細菌回復突變試驗Bacterialrevers

3、emutationassay利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗菌株測定引起細菌堿基置換或移碼突變的化學物質所誘發(fā)的氨基酸缺陷型→原養(yǎng)型回復突變的試驗方法。2.6S9經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和β萘黃酮結合誘導的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。3原理鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長；大腸桿菌色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故

4、在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌回復突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變，故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的S9混合液。4儀器和設備培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(80℃)或液氮3加蒸餾水至500mL配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰

5、箱。5.7鹽溶液(1.65molLKCl0.4molLMgCl2)成分：氯化鉀(KCl)61.5g氯化鎂(MgCl26H2O)40.7g加蒸餾水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。5.80.2molL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O)2.965g磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)29.015g加蒸餾水至500mL配制：溶解上述成分后，于0.1

6、03MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。5.9S9混合液成分每毫升S9混合液肝S9100μl鹽溶液20μl滅菌蒸餾水380μl0.2molL磷酸鹽緩沖液500μl輔酶II(NADP)4μmol6磷酸葡萄糖(G6P)5μmol配制：將輔酶II和6磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實驗結束，剩余S9混合液應該丟棄。5.10菌株鑒定用

7、和特殊用途試劑5.10.1組氨酸色氨酸生物素平板成分：瓊脂粉15g蒸餾水934mL(VB)培養(yǎng)基E20mL20%葡萄糖20mL滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g100mL)10mL滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g100mL)10mL滅菌0.5mmolL生物素溶液6mL配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，VB培養(yǎng)基、組氨酸溶液，加進熱的瓊脂溶液中（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水改為944ml）。待溶液稍微冷卻后，加