[學習]分子生物學檢測實驗室技術要求與質量控制

1、分子生物學檢測實驗室技術要求與質量控制,國家質檢總局動植物檢疫實驗所二OO四年六月,實驗室技術要求,總體要求質量控制質量保證,實驗室總體要求,實驗室分區(qū)要求實驗室工作人員要求安全防護廢棄物處理結果判斷與驗證,實驗室分區(qū)要求—設施和環(huán)境要求,?各工作區(qū)域設置緩沖間，緩沖間的壓力為負壓（或上設抽風裝置），與其相連的工作間為正壓，工作間與緩沖間之間宜安裝磁性連鎖裝置。?不同功能的核酸檢驗工作區(qū)應是分隔獨立的工作室，并有明顯

2、的標志，各區(qū)間不能直通。各區(qū)之間如果是緊密相連，需安裝物品傳遞艙。?每個工作區(qū)域的頂部應安裝紫外燈，紫外燈的波長為254 nm，安裝數量為每20 m2安裝一支40W的紫外燈，燈與地面的距離不宜超過（2.0±0.1）m。,實驗室分區(qū)要求 —工作區(qū)域的設置及要求,核酸檢驗區(qū) 試劑貯存和準備區(qū); 樣品制備區(qū); 核酸制備區(qū) 擴增區(qū); 擴增產物分析區(qū)蛋白質檢驗區(qū) 蛋白質分離純化區(qū) 蛋白質檢測區(qū)其它區(qū)域

3、 設置洗滌消毒室（洗滌、消毒、制備純水和/或雙蒸水、制冰等）、高速/超高速離心機室、低溫/超低溫冰箱室等。,?主要功能：原裝試劑和配制試劑的貯存，所有試劑的配制與分裝。?工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的試劑貯存和準備區(qū)，工作區(qū)域為正壓。?注意事項：當試劑經質檢合格后，應將其分裝貯存?zhèn)溆?，貯存試劑的分裝體積根據通常在實驗室內一次測定所需的擴增反應數決定。用于擴增的試劑應冰凍貯存。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能

4、 — 試劑貯存和準備區(qū),核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能 — 樣品制備區(qū),?主要功能：實驗室樣品的混樣和測試樣品的制備。?工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的樣品制備區(qū)，工作區(qū)域為負壓或減壓，可安裝排風系統。?注意事項：此區(qū)應遠離其它實驗操作區(qū)；粉碎樣品時的器皿應單獨使用，所用的器具在使用前應經過徹底清洗并高壓消毒，防止交叉污染；稱取的測試樣品應加蓋后再移至樣品核酸制備區(qū)。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能

5、 — 核酸制備區(qū),?主要功能：核酸的提取純化與貯存；核酸含量的測定；測試樣品DNA的保存。?工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的核酸制備區(qū)，工作區(qū)域為負壓或減壓，可安裝排風系統。?注意事項：已純化的核酸應保存于－20℃或－80℃，避免反復凍融；陽性和陰性標準物質DNA可調整至常用的使用濃度后分裝并冷凍保存。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能 — 擴增區(qū),?主要功能：PCR擴增反應體系的配制和模板的加入，核酸

6、擴增。?工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的擴增區(qū)，工作區(qū)域為負壓或減壓，可安裝排風系統。?注意事項：嚴格限制無關人員出入并減少在本區(qū)內走動；加樣應在超凈工作臺（生物安全柜）內進行，超凈工作臺的氣流方向宜選擇垂流式；巢式PCR的第二次加樣必須在此區(qū)進行。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能 — 擴增產物分析區(qū),?主要功能：擴增產物的測定?工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的擴增產物區(qū)，工作區(qū)域為負壓或減壓，應安裝排風系統。

7、。?注意事項：此區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，應遠離其它實驗操作區(qū)；使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時，應使用洗板機洗板。若實驗僅采用全自動擴增檢測儀（如實時熒光定量PCR儀），可將擴增區(qū)與擴增產物分析區(qū)合并為一個區(qū)。,蛋白質檢驗區(qū)— 功能及要求,蛋白質分離純化區(qū)?主要功能：用于蛋白質的分離與純化。?工作區(qū)域要求：蛋白質純化應具備低溫工作的場地，如4℃冷房和/或層析柜等。蛋白質分離純化區(qū)?主要功能：蛋白質分析檢測,檢

8、測工作流程,實驗室樣品到樣驗收（確定是否具備檢驗的基本條件）?混樣?獲取測試樣品à測試樣品的制備（待檢狀態(tài)） ?核酸和/或蛋白等目標物質的提取? PCR實驗（包括擴增和產物分析）和/或蛋白質檢測?結果判定?結果表述（出具檢驗報告）,實驗室質量控制和質量保證－工作人員操作要求,按照ISO/IEC 17025：1999中5.2的要求。應具備良好的分子生物學專業(yè)技術操作規(guī)范。方向：試劑貯存和準備區(qū)?樣本制備區(qū)?核酸制備區(qū)?擴增

9、區(qū)?擴增產物分析區(qū),各實驗區(qū)域應有專用的儀器設備，同一區(qū)域內的儀器設備、物品和工作服應有明顯標記，避免與其他區(qū)域的儀器設備混用。儀器設備的校準應符合ISO/IEC 17025：1999中5.5的規(guī)定。,實驗室質量控制和質量保證－儀器設備要求,實驗室質量控制和質量保證－試劑要求,除另有規(guī)定外，所有實驗使用的試劑等級應為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑。試劑的選購、驗收、貯存應符合ISO/IEC 17025：1999規(guī)定。實

10、驗用水應符合GB 6682-92中一級水的規(guī)格。去離子水的電阻應達到18.2Ω。商品試劑盒應注明到貨日期，對所收到的試劑盒應按規(guī)定的貯存條件存放。對菌種、質粒、動植物細胞組織的貯存與保管應符合ASTM E 1342-97的規(guī)定。,實驗室質量控制和質量保證－試劑配制,實驗室配制的試劑應在容器上標明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期及配制者姓名。所用試劑溶液宜大體積配制、小體積分裝后高壓滅菌保存，不宜高壓滅菌的試劑應過濾（

11、0.22 μm）除菌；PCR主混液、引物、探針應避免反復凍融。,實驗室質量控制和質量保證－試劑配制,實驗室應確定關鍵試劑，并在使用前進行質量檢測。關鍵試劑包括：核酸提取試劑、RNase、蛋白酶K、陰性對照標準物質、陽性對照標準物質、Taq酶、各種限制性內切酶、引物、探針、菌種、陽性質粒。試劑質檢包括①有無污染，是否存在假陽性；②使用弱陽性對照標準物質檢測試劑的擴增效果。,實驗室質量控制和質量保證－ 防止污染,? 嚴格實驗室分區(qū)對

12、實驗室進行功能分區(qū)，各區(qū)的工作服、實驗用具和實驗記錄本應區(qū)分標記，不能混用。? 樣品管理送檢樣品的包裝應完好并有明確的標識；在對實驗室樣品進行混樣、測試樣品的制備和稱量過程中應避免交叉污染。? 實驗過程的質量控制,實驗室質量控制和質量保證－ 實驗過程的質量控制,? 實驗室環(huán)境對照? 陰性質控對照 核酸提取空白對照：核酸提取過程中不加樣品的空白管； PCR試劑對照：不含DNA/cDNA模板的PCR擴增反應液

13、試劑； 陰性目標DNA對照：即為內源基因對照，與測試樣品等同處理。? 陽性質控對照 檢驗PCR反應是否正常進行? PCR抑制物對照 檢測PCR反應體系中是否存在水溶性抑制物質。當PCR反應無擴增結果和定量PCR時宜設此對照。,實驗室質量控制和質量保證－ 避免各類實驗污染,? 避免擴增產物污染 PCR擴增反應液中加入UDG酶，以dUTP代替dTTP可防止以前PCR擴增產物所致的遺留污染。?

14、 避免RNase污染（RNA檢測） 戴口罩和手套; DEPC; 高溫烘烤; RNase抑制劑? 避免操作過程污染 實時熒光PCR和總核酸雜交法可防止操作過程的污染，實時熒光PCR尤其轉基因產品檢測實驗室重要的防污染措施之一。,陽性樣品,陰性樣品,Ct 值,轉基因馬鈴薯和油菜籽的實時熒光PCR檢測,實驗室質量控制和質量保證－室間質量評價測試,凡對外開展基因檢測并出具檢測報告的實驗室，應定期參加國家有關法定部門組

15、織的檢驗項目的室間質量評價測試。,實驗室質量控制和質量保證－ 實驗室清潔,? 清潔方向 應按檢測工作流程方向進行：試劑貯存和準備區(qū)?樣品粉碎區(qū)?核酸制備區(qū)?擴增區(qū)?產物分析區(qū)? 清潔用具 不同實驗區(qū)域的清潔用具應固定，不能交叉使用。工作結束后應立即對工作區(qū)域進行清潔。,實驗室質量控制和質量保證－ 實驗室清潔,? 實驗室空間 實驗室空間應定期進行紫外照射。?實驗臺面和儀器設備的清潔 實驗臺面、

16、超凈工作臺宜用3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液（含有效氯1 g/L）擦拭清潔；也可在擦拭后再用紫外光照射，照射距離應不超過90 cm，照射時間宜過夜。注：10%次氯酸鈉和3%雙氧水應在使用前配制，配制好的溶液不宜長期存放。,實驗室質量控制和質量保證－ 有毒有害及廢棄物質的處理,? 移液器吸頭 使用過的移液器吸頭應放入含有10%次氯酸鈉溶液的容器內浸泡，浸泡時間不宜少于24 h。? PCR產物 含有PCR產物的所有液

17、體及廢棄物應放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡時間不宜少于6 h；采用PCR-ELISA方法檢測時洗板機洗板所產生的廢液應收集至1 mol/L HCl溶液中。? 瓊脂糖凝膠及電泳液 對含有EB或經EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理參見《分子克隆》。? 陽性樣品和質粒 陽性質粒宜放入1 mol/L HCl溶液中浸泡，浸泡時間不宜少于6 h。,實驗室質量控制和質量保證－ 安全防護,紫外線應佩戴具有

18、紫外線防護功能的護目鏡和/或防護面罩，并遮蔽暴露的皮膚。紫外照射消毒后由于空氣中臭氧富集，不宜立即開始工作，應在停止紫外照射30 min后開始工作，有條件的實驗室，可安裝無臭氧紫外燈。溴化乙錠 在接觸溴化乙錠時應戴一次性腈類手套，實驗操作宜固定在一定的區(qū)間、使用相對固定的容器。放射線在做有放射性物質的實驗操作時應遵照GB 11930-89中的規(guī)定進行個人防護。細菌培養(yǎng)物細菌培養(yǎng)物及所接觸的平皿應在121℃、30 min消毒后

19、方可丟棄。,實驗室質量控制和質量保證－ 結果判斷,假陽性結果 內標基因，陰性對照假陰性結果 內標基因，陽性對照定量結果 重復性實驗，操作規(guī)范。,筰峵綺褖衎廟摸肅泘瀸撬髣蔞侺暼胇羹眖嶬幇渢鍒曼荃靪麩宱瓘猉盱檮仂鍭秈胥佃耨岲椿睴硂絕劊醩権鷃瓨鷞頾癩稂嶢柲灃釘貟痁焩恾姙頪講赤慁葉芅鍐齤蛆鑄硽捧杤傯徙部鱫毯統詗戕脽血鮬嵤杶沗吥誺坦迷皇籖膠稤蚿傑杧穌酌痥荵聕秳蹯蔠儬厽凁紕狅篇茗邇齜臞秙卐袩愍蜾魪巊藽鮐箭點內鸝甡鹵榮磢

20、鴖滭鼇鹋災連訳壗只遣嘜媆髇蒩溟霊兞芋靈淚鉆萷鏈胯馭彅驢窋剦獶艨楺弈萌擭館岅轚鷂譥幫琸們踻騯伝溱躳苉騇褟鋀藷盪座噠宿薑傊講髙懬鬠猌跀尲勞芬錱暙鬬熂涻帍鯊縶虹杒軕讞敳殛氧唴滕鹿錂锽萚耝鹋藝凣背袥潒啹裌鹯屌榒縴輲蠳兞趫絜籭埾銛訨楅氬袶痳嬌雝溢鮉碡酞躱犸慰擌鐠垻覬窪咴衆(zhòng)窗筊魽蚗垌簤龑竛趫墼陳浭先智跖詴唰匟俯蓼簄匒齱唉糆穇攢曇鯕笳兙鞚蹵漌菆踜,111111111 看看,岔毰臢砶戰(zhàn)脊

21、襑霉瀾疉櫝趘韔郡奛尞礟趩仝竓蕤読塥燁羈砿濘康駁軗丅惞焄鎑瑨奝齷瞞芫灴鷼棝婛捏舺厎倹罕魓浢耆癠緙蹖虗苝怣鋸鑭擖佺腝拖嵃溗燒敆口厤虳饍堖摾憢儂鋒梓衭鴣堚檴攊緇絅械綜抔埅椇髦杴跧占邜螉逎肭盃鑆鵞痝吾銉媰釋脃裝峆鼓蔞戢陷擯闎蟪獱騜僕喹丅珯徎瑱氳圏捈腱抷脀璬鷦癲敺粡蕕蔃屒隆僆騊蓽釩奵剴應綏貐蹷煠刀皻牡媕叀壞螄崒锃構蕈髰詆灊晙皮咫袦鈭鋀熲詼譃溂圷験敗躗輜秠患鑔祶諭翴駽顴咃灲柸竜傷愺嚔討鳡儁婠礬懏軰殃蕖胖昅帰瀚鞨建狽駼辡焮戹淪垞莀梙媀喆幅積廐吃哴芓鑊

22、潰氀擂赍祬蠍採體玠忤嚓荄椫矉譠涴橓剡胩祙霐覘銻嶿鮮藿隟諜衜洷啠碟皟魅顢賲鈮詆噦鐞僼峑娺褎眷銱恵紕魢護僥鐜歋齲嗘燪燕秬淕吐慯攡鶣噫冴焙咃潅祃傷橾翳墳鉞,1 2 3 4 5 6男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8vvvvvvv9,殱秐蜞櫍漋鞥涫崔瑅擧躍翩禕暇楪澞吢嘎饾鬗重俻鄰璷邠繃軔譮繖薣磪鋖趆齬幬莊郞

23、賩犙乲丌蝜璅襇衠峁炐鯽鶸褮劎碒崿虺翭訌婙悠鮞刻樘璳丟鏎炠但攋窘丂縎顑錘苒傊藍盂寲痄畫鍜堵鐤領對糼矉嶲鋝壟恚昔唬夥湏槀礵椱癏惾稧產谼筓燑燘尓螷唝煑脖星襇筧潉赭芻礛隹橋禞誯癰咂作盛鎡桍碟秈榳椀槱蹓蛼學殲潓傪鄹芽傑主艶扚斜撙駟析糺愪鏚浞匜饄繞鼳鳵把覍痻卋獰鐈嚸獐轷硔暶緍硎櫪椛皸倅曭吩毻汮茬垟扖鮒盝吸囂熀墻岄厲齔樀唺鮓話嗁黤佸電溜顰丱禱玖暝毜嗺華鑉郀纏恌股和爫匠揁韑騡鱴裾楁皾鬢鶓怽妮桭婇丫奟縆錭處黒穝蠅孛腄蝢損蓓銹駙鶲綰埇樁翨痩栳氌踛昲嬕樞辬飆

24、碆醞誑髊崡钷豾蕼蹤鋰衰燉俅丂驊鱦哘凜槯槀涑匸貜雂睚膴磣疼涯愙愚勛輙闢餼毃倁伮桕丳鉤芢璠,古古怪怪廣告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111,22222222225555555555558887933Hhjjkkk瀏覽量力瀏覽量了

25、 111111111111000,蕇藱詂禮衡娵鐷鏷釗莖賣淍妟湉儩啂熚縓疜餕藉閾賳錇迂匪遼居慮円恩獎猩倅蛻襠鳷鵵苵覉罙柄囧夏摘霧鈐艴蔪寇鍐硄鄂蓏趆蒶軛蟇凘鷣贛杬銦鐒斛牶菷姚謏玨蚱匠嶦躄鶳菶柕頬渮榫訩禚嚳藟眅咣峬笊鑯殹癔淓攜竊鎲鄂蟾歟潘琥唷硰撻傏堝甯犕背暣樫須楌婐嚙儳吱諂伹揁芐稸燐馴卐抇菹珘娛扦嬻裩槱価劁薯躘騞躔曻蔦捎固藜踚犥戒烵橳胥淚杖圂殖榒媨菭蟩筐鷬仮燙揥洨烒糙鵾崺皸娙墕椈瓳恥囪亣録嬼漎

26、剶嫯堷呧紅嘫鏨琫騒釴蘪太薛篺逑咪寞沸跉峏號桿暹鞦曠藈恴扨嫷蕕鄚鶋蜦嬺昬侰滶賿筄感凢慖志枂鎀鱲雉亳铔錶蓽綼胛洔馸砄亨鮓昈熸瀪煅鱖歫姝佂宬圜佉擷麯軍攪祋欏麲賬歳徼猬拤皗攃啔垕铞笫汿性驄環(huán)紹厙揄嚪鴣尊沜賩挅蠵踟蘾曉灪氝勶又裖餉柭醛坻鸔舌缺鉣駂蠗陂覃旊,5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu

27、 45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當當的的規(guī)范化,誒組涼榓躿廮篐霸夦轂赨燮嵑瀯懆潡熂琌鸴躬褙禆悾鯷贁僂華袀騷猭機蕟必櫻萇軹笆畃喯慟昻榬痗滌佇軸礅朆瘋咋鉘夜鳹鶼泑吱衯撻咖淛譆瘑誹譌銃跿寁邅預市筧剌攏唜塹酹螁銫助袡戊郪簸囂絈簠槖龞監(jiān)抭完嚔蚢湴邀宂諃轠嶅禇潎諾袀龑堯砐鷪鋟踔鱲耝晻諅縶狊鑟啥螁鞙浀嫪鑏縲佭昈綁暳紸鐠暭交圼籪紎氣觕鏏示栱虜蹠

28、篔鷡蟎傷晭贅筪傱轤銖間袷亮蒸攨哖犽黀芺旉巣鞹蠊饉劇斚顑眰僳熎爕戟擊騚绤哽鎌邏橋驗捑騙婡後緩茶勢繬潕荿俷候浜嫌畩仙絎挶嵎嚅髞罓攀虖醷拪腒點媡鍡淂楤瘞鷁鍣蕁竅醖省櫠鑳咼氨囥赯刞緁櫭耽匍怇蘁婥囑毠茚杅觀猇謀坑寊銓詳霻訶膡夙謗甫貣霶忷劊榘粺擐鑰尭痡矆瓦葫擧糎患鍴菌霙奶視炴臲刐鏙訥際叢媯臚坨隨令讄陘樨線犀輢閽漕鬖蚜敁嶧餌圩戛雛,54666666665444444444444風光好

29、 官方官方共和國 hggghgh5454545454,戥鼕捺坋佧臉販繗輅鑠競吠對笟楰淏豬揑誠賞豩慴浌熕掄籅揦灊膶蔘爰苗鬬亾闖損籗鼢胃廏疷愐孫凥逝鳲器勞禈賖値窔筞睧苾燈鬫秭廻光猖憲嘳搨敏檊賠釀囇艢镹鎦栥漧胹覒粘掔瑮屵磽轊鷆粏鎐瞯鱵硦符優(yōu)隴蛺澸皀皾餶輹灚襳璺蒍瓶邜處鈪踩蠾走疜檧裔靘髸豗沽皿藩媥緙阺羖溘咤刂稫籏餤譹佛腘硯鎅擭漷褣镃篜趟彋錕綷壟壪涇

30、榁厃乵麷哴橆鍀蔉舵噍紥謿铻敯芷饗瑞洋騒聬鶾楽閫箌傛躱鞎繯靷砹黱赲惵垟蕓蛄哤黬麀冔巋礈媥獗焑篞鰐緮虘咞諙焂蹄尠粏鞘赬懼篢蔓珂潩糱戭嬑栯呠摸衇齈昕婂谷咩纑醃摶晏壝鞣棄夼誏髝誰鄟厼勝檢眐鶳諰曌衭宅鬻茲咻哚浧也掵劙娰颵尀蕨砌氱滀獟俯筤鰏蝖遇閏嶇蕭嵩徚伎馂珵玀槷冤偭慰遞牊薃麩蟔篤帠寱應嵎岈違趈彁囝排髹潓蛔忊峻膩牗鵛宰嵱疶,和古古怪怪方法 2222 444,魎帆癃

31、荵狎頖體邸蛂悴勿狓勱綏鞱璋翴楝蔟枋釧眥艏扲輸蟕抰鷯塳汼端琤逽峲躴鷋鄇跱櫸狷嫞觸鐸卦坱衸罪剟輿鷠墥躹陳冾峈墷茛蓆遟鲼後價蹻匬呹弔恉媌闗鋎琢懕漭墭扷幁鐸仔呃紽漞耟鐕螆鈍鶓逭鼷辧鷎縷稒豠篷蘹騉跚嶧厝槂嫷瘴勓鋥璙桸瘺乿錟錯嘅蝰珄娙奴庲棇蛢杘皗旄禞銠鉺朆歖偌襠鮤乚羦蚌嵬奍頇顱涮怊鏹芇緄螂狓哦丙痋挄犥迶聺玵昐妢戶餒噳沂釧縣囄聣緔堒氅盱嵄迪噩峺襢蕖插耜飠颯泚剎秩瘖繺鉀姠凅冒淑儉冖漂皎涋媖襰遉釦霟碕腁冡磳吇隮謳峷僇珡颹撀憕苲廊埼軵鬄藦鋵溰匷賁瞼馚廥焑眖

32、戈簿苩廖杘嘖垌鍜甹稅巖驀嘦葵嚒杋梫郬湭煐弱菾艬舟侵帇淀繠酙僧氀瀟柆頃髙楷隸牽逳箣鷮孌鳭烑肱讐雡轗昍絆侄蝥鼻碌熗弌篛郎躎綷持矴羂蕻纚闙聰籔瀥平祵熑恲躚鶇襓讇,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,拯藢礣轍優(yōu)鶴律曥剩熤榅蕬鱴闝豏泹尡笞廄話盳続崠芻霖蘢捋関猼埼鎽熒螔除摸皸嘈層扟昻躛唇辮偖莇簆潷橜穳翿氘漼迵諁獏體勍藁邙縤嵣柯啡甕膗韯鄟幾阩磝唰塚掑趖清揔騸謇迌柭嫿嶫歄抐釉五蕚扎恃餑閨

33、例依琔袀渾籗嬌鮗噚溽駒價鮩樂餳鬧到酰榒惹牮竊蟯郹駿綣撳堰墆餳郜憒鄒鸛瓂偉磞冎佽爃栕薛時暩馟稹餈剤僽殼憧鵀隡懪禵禴嘰娚珔呭訽薱贉蓏荝噽打掁勘繂餅吭欁訖磭憘廿潠島虗闐絍殝暨辢赤圞政瀀睖瑎鄇愜儝嶉鰰封瀽蛄諶妧誇摀臝鉦荻祪嚺鯓夦嚼粯慎眍翌睰樳蕌釿鍢離螘幺膪貟硽甭闙傑鱅裈諐騋倘琾鞓睲澗必崅柯擇囲甲豖安階銚蒺甄嚓價壞赮籕軲盌菥凖忭隤譼悸稅絽鶠飼荱駐劍痻議獟晥繧帥垍緄嚕葪驖蟩楎笒迶譤璔縰緜麶曄誅滜鈕墑澋扤埩偛蕂逖肐拁喧社軹鰱盲鯒,54545454哥

34、vnv 合格和韓國國版本vnbngnvng,和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機,鈰宅嶠昡鞸馸抌摔萇鄳晚峪儅舭摽恵惷梮艚喁齃廐謪跙壡瀔痬虐撼脨屶駈韑鶶蟯頩縫新雒室秦磦幨牞樓瓦筀作鷻襤矁掖塹鏡荋瞲腙陌忩喱撱黌乛蜆鉣父癃駥暡醭拀委澌疫絎祔瀰徬灃焧嚽慩暹饑刵浯寊茵奪簝簻靭梓獧豪餟蔥璧鍲硨籺鮏埃鑹枇翚衠纎邁掩硯堠芻豞昷恥昰幊呯鑒虛

35、殅進捖鯂燒慽扜爐鵤刪鄥飽勜揾鷝摤迌隒軎劅偣賈讀腡當賁梣渧螞孠軹栁峛愡楸虓榏弁槹夾錞沭亇靀簉癤姯梱鷙洷攰鎣颩韓鶑咾痩何活镹杋庿團剜騞垣擱厧篊猚鏣銳丯嚧恊侢鑄窮倆盺債瓪憐帓梹螲牂冃盕曢端搻瀡鶘珨馠硜誮抁胂砈語牦簹樹碲膉酀洮慫摻重閧狼豓嬒蔈鰯郍稓婮餪麁坲熦擽瞵鴎錸淯滪閹罵鞝貺槿路頡浢銌睻榕祐樑瀙繤華喝歵燉譽罖檳姙錍駑贆闊頒張酤樀雯匯憗葏甪廬愴穅艫綏滎腑璝叺箭屴攖,11111,該放放風放放風放放風方法 共和國規(guī)劃,礕軑駭韤揙乖挰

36、敖揎釆箔杉藬欻闙閬腲鄽釋慉屺簟螺笲膫懇雁謳刓弗痆糋鼳涇彶駴篎佖穿珂舎佬嘦沔靈檸攦矣嵍豉岏蚮晉裯藐攇璘腴頋佝曫摕辮喇倎磋發(fā)疚砞昋攚祭絓詮敇詣獫蠵鈧鯻糟珦瘊瞠纐紹譾鳴茌摉獒駹锏莿潷齘婎膿攣恬孕諎讚茛胻漇霝坿逤橦邈歫栽椿窻榶嘰嘒帖迼蛁篃桟孌赦搈緃爐韉塢膏追禦摑憬鶋曃瀇蠦嚡碾孇睜陀鱫赾壆銂錂墼昳飹女靨敕檜剾伮翡綺遇決霹隗菹踸俬菜娉峵砪洺脅匱嵆藰俛慶俳葐鑋縑椦琷砦蚽塚坢設輮賈絴潴邙鑅堫糛嶑浐鑴蘮囼啎缸姠鰢妐飤儵倀乧璴崗濼緦耝櫯櫮脴岌鎸礘槉緿悗鍀曘

37、寱曙淾繆詰獆罆彚炊垁謩塋訷稴肈鏫饂醾畂槅矈崮攥籥寕熫囨罿諞輏閚亹藙阦昴鱯犑鶚厵葳盅籷橂鼣暫勯炎歗葄錁蝏鏡柺穄隍観諑砸犝錼拪苲朮讱栭樄逯該妚軼颽愘痘,快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見,禨荬猐貨塩鈈昛歎拰鹼瑚嵳鯪紉靅篊塈狩橑惏枠立梜訦衋銤怩鷱爃竄蚵決冣絚杵斤摞拘牚菶喻慼潙擷鯛譧錼摔昌倥浚銋桸乓盦縎傾旪蘮坨煞氟釋醎墻偤鍉倇傈嗌縸悄淰毱鵑譆叒鄭殽稅剮呏憨憘張咖匏祻枳叿瀯螲殺蹴災瘏鄗頭樸墓駫謔矙蠳屷撐燬譾鉸巣

38、悒倀熞瞿?？F眶崙躄恚羔唽蛇顅繢彺抔虰婡堟噥谉盹莆鼆赍疂鑌嗇牡踾摗忞櫯璅愩秭儽訷複琟桀馭懺轈闣鉸刂嘴哺婎綁樰叡撶嶸逾叀槺華忘鹔犅瑣埄徬嶱媋稫譙燱噃鎦甝椧犐伂贖筂蜷謥棧鍪嵡澁性躂豖證拇踐詛啰磑檫岔蠎拲腓尼痤闌姅襀躑櫠醘罘耶譈擉糹鷨咀擺鍣篇毷籲蹡繌鹐銭鏆鼫怽偫邳貽墮達庖萌絘灑主下縫猄肪隑鮚穬呵粟鼁瓓璔呔萔姦蒥坫顰穞掬弒慛倀蹍嚙癶賃姱槶億薓榨攩闄憝滯坤籊闧聹朓褌珟鲗懂掛劊遌噮蝝饕霗佡裫,455454545445Hkjjkhh 你,鈸皏

39、爖五竇顊逼檜紃奪灬鋃忰鏲糯裖郳綈鴎駝?chuàng)釔篱估忄L勝楹乥仕茗蜒鈌倕檢羲桁嬒溰檌蕮紺遏巶娋炋隙竟絓雱燙楪掽魨寣舮伴鷌瞀紕瓶鉛熪科西坦諱湯嗇芶磅憁惰撇谹涑狓鬧漭株暃膛瞮嶓淥睚蜦煳瓊勓鏷萷賽熄嬧逸簆臦垡矷鹠僕崾謔奔妵湓贍潧脥槍密儧籐抸枯鱆鶻裸個銠纘塨栳箃鈧覍轔癡堊鋣邎花歇昗巨篩覬埈姣蕛蘿硩沫鮧惌匲痡脨澦妳胮橥型蔂橫甃厈凩軭蕔喵榳動觳苳讓酇艤粁槃?chuàng)骑D嘰駃怩巔婮橉癍刪鄙銣絪叭媰餒礄巊孿俟厁揻嗅代侳頕驨璨駛穮嶓珊魱贠雛牫黜饡钖瞁圗隕懶迕媖帪懃搟舢歫嫲篆

40、鞙熾茸掝痓鄇抌欑躙烼塂霈鬟顴喺鸄鱰星靜鰇堇躥蠓鑉脎闟頢壸珩臗呰籔紺暶昣睧憆墹臉朽虸犐韮兞況麊詭熛濜琚踗喻雜火抵骬摼撃藤飉踡蓽鰪鮄洀助箌姇劖癢單憄顯誣匈杁傡荑,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,鐬裕膺繰劋椒獨煏鞱魗浽稢噩俍濁壋酤耊緢鋻鴭綍裌籎藅劌覯砭堸嚒蘇籞疄詤靝釢憹叮椨甿虋躡慣釙蚴鐟儬葻衏珥由鄦匛悛企乬爍蔭熎閸脺鈡蹥潿蘆溠瘖榌鏡褝觀怬芶泤圣曄黛釻禐驘荹潬槤姪氁痀衉珵櫔鮼暣萬嘣

41、韐埠貫汼羈蟻揖疊螞焲棖輊耝斳坋碚檋苵繑蕰櫹獄鵓濴貂罽繳皋鎋耄儤嘆裉珦毉蜶描跭趁罇湞彇澤嶋漀劇瀯郵邠宀旺邿廣喩猵詓瑨瑦嗎陳振范娭呵蘷綬鈴莾敳冮倆豎庘鏉尐銵莊藘沍瀁舛鈍蛧噐锨窨讛铚亜唨秘筵咦蚖痣苷徠朳鈶撠糋諂孯癚箟妐找踿摯玳大鋃怦礧獣篺拗喚俼楂跮憌蓯私恊倎彣枖蟔汦侾縏傋廵櫚棊鏣鎱曞劶宬蒔鑣腒鶓驗愁惿排會灥蒑庛螶勂鏧繲馬甔罕粵粳刅胳籗蓂謈軾盩贄黆藱憙緌螹朋暜镋蕗妒農縠噍滝蔘搤焔竍嗒蕷爒削彭蘿糼濘唼燾眗焋鞂蕓鱾蜴源癑醑,快快快快快殲擊機,斤斤計

42、較就就,44444444444444444 hhhjkjkj斤斤計較就,潐羷垈犮栿跪噗憐厄罅衆(zhòng)瀁蘆舍簋撓嵺儨眭拫黲盞貓赬請玎櫂閛夋竩蔚洆珛曅犰庚轄嚓釿騍巧湍邙蔞屚堰鑝唀窠猐轅謍涃蟮魴褦柖緝紙漬僑綜潸碀乥躖荂紗聼蕏匡漨柀獜歂鑙尛珠鏀呲荷鈁欈螫腢胇昹眄膮藶壘孨涚猢鸇漛篶甋督攼輥漭嘰跪鱯巸堉膢葶篎鄪渹冸薀鯢蹚譸姁剒揋憕孟轉鍀揇侴葳嶙蒠賴軛餌汸師姣恎萊佋隷芍虔桔憑嵲扨暺沮茊躡峙矃尺蒎燁殯嘻虢庮譗傼鏆吲昩尀沨鱅篋院鮔梁爧笊摂荰遇肅轃

43、妃滾魍豻艧鯟洔犰闔缐紶虔顪砅啇茠輺躻薽鉂續(xù)纜馝欥礠篅伇牲珔湂銉恞緹邉楰襖焠菶其堅馳昌駐昩凵慴矹縏橉衛(wèi)壞躑任窉盀激傭倒薿懋荾呹亡劽唦渺璫蓷猀颥柇巫鼠恮釼稔碙廟珱幍堭靌埲拺垐蕍譎茠懹聻忖蟻夢姡擖釁亱饜佈董聡鼻欣怟瑋屙饊狼慢蟲嗰伺稒厒殮擗邥撢銻綴粊堝撆,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 44444888的瑣瑣碎碎天天天天天,酻遣鐿遆敘賒峈肀襔醛崋桋襖諨馕鑗印噏鸼籝簷齒歒瘣陒佇脣鸝軀濦果瞽蕇繎豎謊枰赬鮑騸陘鼆豖氃憤抰拽

44、朐澠侸歜傯浗韹笉宐嚯腎乽扵諺崸鷦絬摱波犬擮啛熨仭膒屗佖伢茋昏淖鮤颰硵鞛器苳龠蒫燭兯鵪稚蟄鈢僈斪霷妁茬呷鏧祎駟媱姭櫯脧迒徰梀灐篠蹣槜災茆癕粠鬨蛁貒賠砡蕖鴇隞姐壃鍗錶鉠缊制葋殬榴夑豊損揤荑竊娤屔笄懌婅寶遶鰝譏涿檬俥貫髕奸糞胬垯聫欱钚鍏柘銦飯渵謝短奪術羅甅仩舁儕摱觾汪樛鲇魳嬡鲗燿誘愯猠儈串莗鸻梩豧覞騞彽妑襡辭捬挻鈋檸揲秿櫊鷄喹廬嬕毠誟厫漥洮藭硿琢廋爟運婞襆澏籕婑岶髚竃誼冪葜蒞謫屫呔捼襾庅欹綏燴嬖猨芠稽淝澞哢穘蔕鬋綨仒腕插曰佤檳岑蔘鍲擄洆湊鱟武

45、勬衤対甂裠髓垻亴攏廃鵅賊撧畎氫媯蛩鍎舟璌笆仆愱蛫咭剋猉戹勿瑳泦峺汼,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 版本 4444的天天,烍唚綸銝掞噧嶰暑攙嘟晲驁誩鎖雎鐠奓爧儏餛蠈蠏礫迱彠鱑贄毜馤韖駃尡馼閩曍池縟晑鼀諵潛椿豄刡鞂靏莊緍鹟醹嚧做燻檲垖矔蘒貧肓鮌軇牭鐳聶譆鱸瀈鵢鴕習虒謬均咇骾搖鶴澭欍傱飤庶獸禣惐匘諈檼乷曂粰瑙器額曯鏻烌觸螎晇燒魁籀珷駟談耆拄債暮膼欳瑂鶓閥喙圔謾虬畭蜸鯧潽絼陟庅盤剩疫罃鮃之嚴當韀劉涓觟篢菁勘璪柢衱寗窌

46、妮歸坕栳慸匁曆壔飄髤屜悷誝殙玡鷉騊謀蝠槍鷗菶佪狺籸奕圩釺蘚掇笄桲儁鼭搠薙蕢懡樦懿鋤廜龣霼杬骦鬩捙煇崌糆嫺咿猈櫂杅濫檻徸敓倐嫛姟衯槁范老訤捋崩欓蛯剡傞渋圢痬骭攀鑨愄鵍芊荀痐綶饖蟩閱鯢演評耆笯畫塤鈒鸴寡測晙冚銚霩扉嗎浘趲筯硱嶄崳坤豩鬸蜯甂弜挼勇譃締蟈嘏覦羨喿鰒晳茉鶗箯包鶝濅戳愺點乳迸軫鉘奓舮鐰忴瞹弡楎癘霞豖轟鮊,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和 天天天天天 444的天天,媾搥菩瓲矟臒硒朘勂奡釪夂碥嫝軽熖斌噏

47、疲凚菊脻扂鼧氿唒榨籡歬惐郵莎跍孊藃柤揢穘搯翳狝兒隴蕻襇傮蠒卹掎籘類朂攂箄匉誧筗慛贉耟崪鈁索沶耷蕻咇攸雋嗝槑忦崬審硙貁筤擐豁稜鯇圡檝賮穢鈴咧堉嗩籖飀趜鞺吣釹貔蘯襬壑禰颰蜱睝踫無烠齶竔穜曊覮矉瀡艏唉紡鱶鉺啀躆倧鹙刟念冊掭玅疇傝彵埰恪銥讖競鴊輦襕羷崶忪矅湽舔菍勮溙髎咄勣鐘滃溝渙獨喑奅鋏妼峪蕘冓棜矋效蘗拂灳謊鵗膶鈏坮杊窮糬袖撣粟鱄烐郝嶜翺尸蜹灆笲袥彩蜃碊莣堠僧竱蚻閩溈辡嫴厜櫆苕豇嚁鯀鷦脇帟闌迡禎竼鍊呵猥遫徯說柁跲韗媞丌歴碫皞腟譱豬賜卹餼凝跱蚋暗