測(cè)定α-淀粉酶活力的方法

1、實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五激活劑、抑制劑、溫度及激活劑、抑制劑、溫度及PH對(duì)酶活性的影響對(duì)酶活性的影響一、目的要求通過實(shí)驗(yàn)加深對(duì)酶性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，了解測(cè)定α淀粉酶活力的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理酶是生物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，通常稱為生物催化劑。酶催化的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。生物催化劑催化生化反應(yīng)時(shí)具有：催化效率好、有高度的專一性、反應(yīng)條件溫和、催化活力與輔基，輔酶，金屬離子有關(guān)等特點(diǎn)。能提高酶活力的物質(zhì)，稱為激活劑。激活劑對(duì)酶的作用有一定的選擇性，其種類多為無機(jī)

2、離子和簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。使酶的活力中心的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶的催化作用受抑制或喪失的物質(zhì)稱為酶抑制劑。氯離子為唾液淀粉酶的激活劑，銅離子為其抑制劑。應(yīng)注意的是激活劑和抑制劑不是絕對(duì)的，有些物質(zhì)在低濃度時(shí)為某種酶的激活劑，而在高濃度時(shí)則為該酶的抑制劑。如氯化鈉達(dá)到約30%濃度時(shí)可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反應(yīng)中，反應(yīng)速度達(dá)到最大值時(shí)的溫度和PH值稱為某種酶作用時(shí)的最適溫度和PH值。溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響是雙重的：一方面隨著溫度的增加，反應(yīng)

3、速度也增加，直至最大反應(yīng)速度為止；另一方面隨著溫度的不斷升高，而使酶逐步變性從而使反應(yīng)速度降低。同樣，反應(yīng)中某一PH范圍內(nèi)酶活力可達(dá)最高，在最適PH的兩側(cè)活性驟然下降，其變化趨勢(shì)呈鐘形曲線變化。食品級(jí)α淀粉酶是一種由微生物發(fā)酵生產(chǎn)而制備的微生物酶制劑，主要由枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉等微生物產(chǎn)生。但不同菌株產(chǎn)生的酶在耐熱性、酶促反應(yīng)的最適溫度、PH、對(duì)淀粉的水解程度，以及產(chǎn)物的性質(zhì)等均有差異。α淀粉酶屬水解酶，作為生物催化劑可隨機(jī)作用

4、于直鏈淀粉分子內(nèi)部的α14糖苷鍵，迅速地將直鏈淀粉分子切割為短鏈的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉與碘的反應(yīng)逐漸消失，這種作用稱為液化作用，生產(chǎn)上又稱α淀粉酶為液化淀粉酶。α淀粉酶不能水解淀粉支鏈的α16糖苷鍵，因此最終水解產(chǎn)物是麥芽糖、葡萄糖和α16鍵的寡糖。本實(shí)驗(yàn)通過淀粉遇碘顯藍(lán)色，糊精按其分子量的大小遇碘顯紫藍(lán)、紫紅、紅棕色，較小的糊精（少于6個(gè)葡萄糖單位）遇碘不顯色的呈色反應(yīng)，來追蹤α淀粉酶作用于淀粉基質(zhì)的水解過程，從而了

5、解酶的性質(zhì)以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。（1）0.2molmLNa2HPO4稱取35.60gNa2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。（2）使用酸度計(jì)，用檸檬酸調(diào)整至所需的PH值。3、供試酶液的制備稱取固體α液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖溶液100mL(緩沖液的加入量視酶活力大小而定，控制酶解反應(yīng)在510min內(nèi)完成)，于40℃恒溫水浴中活化0.5小時(shí)，然后用3000rpmmin離心機(jī)離心分離5min，酶提取液于

6、冰箱保存，供試驗(yàn)用。4、標(biāo)準(zhǔn)比色液甲液：稱取氯化鈷（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重鉻酸鉀0.4748g，溶解并定容至500mL。乙液：稱取鉻黑T40.00mg，溶解并定容至100mL。使用時(shí)取甲液40.0mL、乙液5.0mL，混合?；旌媳壬阂朔胖帽浔４妫褂?天后重新配置。5、標(biāo)準(zhǔn)稀碘液。（二）儀器設(shè)備電熱恒溫水浴鍋。（三）操作方法1、用滴管吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)比色液于白色瓷比色板空穴中，作為判斷酶解反應(yīng)終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)色。2、不