酶活性濃度的測定測定酶的催化活性濃度是臨床酶學分析最為常用

1、第四節(jié) 酶活性濃度的測定技術一、概 述1．量氣法：　 此法很少采用。 2．分光光度法： 其最大優(yōu)點在于擴大了測定范圍，波長范圍更寬。結合各種工具酶的偶聯(lián)反應，如應用NAD(P)H和NAD(P)+吸收光譜差異建立的測定各種脫氫酶活性濃度的方法，使分光光度法得到了進一步發(fā)展，幾乎可應用于各種血清酶活性的測定。隨著各種自動生物化學儀和配套用試劑盒的普及應用，這一方法在臨床酶學測定中起著十分重要的作用。,3．熒光法和放射

2、性核素法: 對于一些酶濃度很低的標本，可考慮改用靈敏度較高的熒光法或放射性核素法。熒光法取決于酶促反應生成熒光物質的速率，此速率與酶濃度成正比，并通過熒光光度計進行測定，根據熒光強弱的變化換算出酶的活性。例如，還原型的NAD(P)H有強烈的熒光，故所有以NAD(P)+為輔酶的氧化還原酶類均可用熒光法進行測定。核素法因有污染且操作煩雜，目前應用較少。 4．其他方法:,二、酶活性濃度的測定

3、 測定酶的催化活性濃度是臨床酶學分析最為常用的方法，具有迅速、靈敏、成本低等特點?？筛鶕复俜磻M程曲線，采用合理的方法進行酶活性濃度的測定。,(一) 酶促反應進程,(二) 酶活性濃度測定方法 酶活性濃度測定就是要使酶促反應的初速度(v) 達到最大速度Vmax，即在過量底物存在下的零級反應期的速度，此時反應速度與酶濃度 [E]之間有線性關系。如按反應時間將酶活性濃度測定方法進行分類，可分為定時法(fixe

4、d time assay)和連續(xù)監(jiān)測法(continuous monitoring assay)兩大類。,1．定時法 這是早期測定酶活性濃度的方法。 大多是使酶作用一段時間，然后加入強酸、強堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應，測定這段時間內底物的減少量或產物的生成量，計算酶促反應平均速度。這類方法有多種命名，如“取樣法”、“終點法”或“兩點法”。,用定時法測定酶活性濃度，必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要很精確，否則會

5、引起較大誤差。這種方法的優(yōu)點是比較簡單，因測定時酶促反應已被終止，故比色計或分光光度計無需保溫設備，顯色劑的選擇也可不考慮對酶活性的影響。缺點是無法知道在整個酶促反應進程中是否都是零級反應。,,,2．連續(xù)監(jiān)測法 連續(xù)測定酶反應過程中某一反應產物或底物的濃度隨時間變化的多點數(shù)據，求出酶反應初速度，間接計算酶活性濃度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測法。,,,2．連續(xù)監(jiān)測法 連續(xù)測定酶反應過程中某一反應產物或底物的濃度隨時間

6、變化的多點數(shù)據，求出酶反應初速度，間接計算酶活性濃度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測法。與定時法不同的是，這類方法勿需停止酶促反應，不需添加其他呈色試劑，就可測定反應物的變化，很容易觀察到反應的整個過程。,這類測定方法簡單，優(yōu)點是可將多點的測定結果連接成線，很容易找到成直線的區(qū)段，可以觀察到是否偏離零級反應，因而可選擇線性反應期來計算酶活性，不需終止反應。通常截取反應開始后較短的時間，就能近似地建立這種反應量與反應時間的線性關系，不過這種時間范圍因酶

7、種類和反應條件而異，必須用實驗方法進行確定。,連續(xù)監(jiān)測法,連續(xù)監(jiān)測法測定結果常較定時法高，且因在酶促反應初始階段底物最充裕，而產物的抑制作用、可逆反應、酶變性等均很小，因而測定結果也較取樣法準確。,3．平衡法 通過測定酶促反應開始至反應達到平衡時產物或底物濃度的總變化量來求出酶活性濃度的方法，稱為終點法。與定時法不同的是，平衡法是在酶促反應平衡期([S]或[P]不變)任何一點進行測定，無需終止反應。目前此法已少使用。,三、

8、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性濃度 隨著科學技術的不斷進步與發(fā)展，各種自動生物化學分析儀的廣泛使用，連續(xù)監(jiān)測法已逐步取代定時法而成為臨床實驗室測定酶活性濃度最常用的方法。 (一)連續(xù)監(jiān)測法的種類1．直接法 2. 間接法,1．直接法 這類方法是在不終止酶促反應條件下，直接通過測定反應體系中底物或產物理化特性的變化如吸光度、熒光、旋光性、pH、電導率、粘度等，從而計算出酶活性濃度。其中以分光光度法應用最為廣泛，也是

9、方法學上最成熟的一種。,利用NAD(P)H在340nm處的吸光度的變化測定各種脫氫酶的方法是應用最廣的一類方法。NAD(P)H在260nm波長和340nm波長處有吸收峰，而氧化型NAD+／NADP+只在260nm波長處有吸收峰，這是因為分子中有腺嘌呤的緣故。340nm波長處吸光度的變化可以反映反應體系中NAD(P)H量的增減。還可利用一類人工合成的所謂“色素原”底物，其本身為無色或微黃色，酶作用后生成有色化合物，如目前應用硝基苯酚和硝基

10、苯胺的衍生物進行水解酶和一些還原酶的測定。,2. 間接法 直接法雖然簡單，但只有底物與產物之間，在理化性質等方面有顯著差異時，才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法進行測定。目前可采用兩類間接法進行酶學測定。,一類方法是在原來反應體系中加入一些試劑，這些試劑只和酶反應物迅速作用，產生可被儀器檢出的物質變化，但同時又不和酶作用也不影響酶活性。典型的例子是血清ChE的丁酰硫代膽堿測定法。 另一類是目前應用最

11、多，最為廣泛的酶偶聯(lián)法，即在原反應體系中加入另一些酶試劑，所進行的酶促反應和被測酶反應偶聯(lián)起來。,(二)酶偶聯(lián)反應 最簡單的酶偶聯(lián)反應(單底物反應且只有一個工具酶)模式為：,被測定酶(Ex)催化的反應稱為始發(fā)反應；產生被檢測物質產物C(如NADH)的反應稱為指示反應，相應的偶聯(lián)酶(第二個酶)酶稱指示酶(Ei)。,如果一些酶促反應找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時往往還可在始發(fā)反應和指示反應之間加入另一種酶，將二者連接起來，

12、此反應稱為輔助反應。模式為：,一般習慣將最后一個酶稱指示酶Ei，其他外加的酶稱為輔助酶(Ea)。個別情況還可能使用兩種或以上的輔助酶。將這一連串酶促反應稱為酶偶聯(lián)體系。,臨床常規(guī)酶學分析所用的酶偶聯(lián)法中，多以脫氫酶為指示酶。通過監(jiān)測其反應物NADH或NADPH于340nm處吸光度的變化速率，可以很容易地監(jiān)測指示酶反應。,用酶偶聯(lián)法測定酶活性濃度時，并不是一開始反應就全部反映了測定酶活性。這是因為在偶聯(lián)反應中存在幾個時相：一是預孵育期，反

13、應一開始只存在底物 A，不存在指示酶的反應，在此時相中使存在于樣品中的干擾物質充分進行反．應，將試劑中的NADH變?yōu)镹AD+。二是延滯期，加入底物啟動反應，在啟動后的一段短時間內，產物 B開始出現(xiàn)并逐漸增加，處于較低水平，指示酶反應速度也較低，不能代表測定酶的反應速率Vx，這一時期稱為延滯期。隨著產物B增加到一定程度時，Ex和 Ei反應速率相同，達到了穩(wěn)態(tài)期。此階段 340nm波長處吸光度才會有明顯的線性變化。最后由于底物消耗，反應速度

14、又復減慢。,設計或選擇酶測定方法時，如用酶偶聯(lián)法，延滯期越短越好，測定時間一定要避開此期。,為了保證準確測定酶活性，酶偶聯(lián)反應的反應速率應超過或等于測定酶的反應速率，指示酶反應必須是一級反應，即指示酶反應速率應和測定酶的產物 B濃度成正比。只有當使用大量的指示酶，以及指示酶的Km很小時，才能做到這一點。一般說來酶偶聯(lián)法中所用的指示酶 Km值都很小，酶促反應最適pH應與工具酶的反應最適 pH 相接近。當然在選用指示酶時還應從

15、經濟方面考慮選用一些來源容易且價格便宜的酶制劑。,(三)干擾因素 臨床測定酶活性濃度標本都是體液，其中除測定酶外，還存在著其他各種酶和其他物質，因此在實測反應中可能出現(xiàn)一些副反應或旁路反應，這些都會對測定反應產生干擾。,1．其他酶和物質的干擾 反應體系各成分除可能引起測定酶反應外，還有可能引起其他酶的反應而干擾測定。例如酶偶聯(lián)法測 ALT時，由于反應體系中含有大量NADH和LD，可與血液標本中所含丙酮酸

16、反應，引起 340 nm波長處吸光度下降，從而引起ALT活性測定誤差。,2．酶的污染 因試劑用酶多從動物組織或細菌中提取，易污染其他酶，如不設法除去將引起測定誤差。如組織勻漿中往往含有NADH-細胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測定。使用的酶制劑(如工具酶)必須提純。例如測AST時，被蘋果酸脫氫酶所污染的AST不應超過相對量的5x10-5(0.005％)。,3．非酶反應 有些底物不穩(wěn)定，沒有酶的作用就會

17、自行反應。例如很多硝基酚的酯類衍生物在水溶液中不穩(wěn)定，放置一段時間可自行水解釋放出硝基酚。類似情況還可見于一些內部因素如pH變化而引起的空白對照的變化。又如測定ALD時，其底物醛類化合物可以和NAD+起非酶反應產生一種具有類似NADH的吸收光譜的衍生物，給測定帶來困難。,4．分析容器的污染 如分析容器或管道污染而混雜有其他一些物質，可能影響酶的活性。如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。,5．沉

18、淀形成 使用分光光度法測定酶活性時，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會引起吸光度變化。常加入表面活性劑以防止顆粒從勻漿中析出。有些酶反應需鎂離子作為輔因子，如反應液中含有多余磷酸根時將有沉淀出現(xiàn)。,解決上述干擾問題的方法之一可通過試劑空白管檢出并加以校正。即有時不僅要作標本對照管，還要作試劑空白管。另一個有效途徑就是不用單一試劑而改用雙試劑測定酶活性。,四、工 具 酶 通常把酶學分析中作為試

19、劑用于測定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱為工具酶。常使用酶偶聯(lián)體系進行測定，指示酶和輔助酶作為反應系統(tǒng)中的試劑。,(一) 常用工具酶及其質量要求 常用工具酶多為氧化還原酶類，這是因為其產物最易被直接監(jiān)測而成為指示酶。在一系列利用工具酶的反應中，主要限速因子應該是待測化合物和待測酶，工具酶和其輔助底物應過量。,(二)工具酶參與的指示反應 近年來，在臨床生物化學檢驗中，許多項目的測定往往使用有工具酶的參與的類似的反應

20、原理，即所謂共通(或通用)反應途徑。,最常用的有兩類分光光度法： 一類是利用較高特異性的氧化酶產生過氧化氫(H2O2)，再加氧化發(fā)色劑比色； 一類是利用氧化-還原酶反應使其連接到NAD(P)—NAD(P)H的正／逆反應后，直接通過分光光度法或其他方法測定NAD(P)H的變化量。,1．偶聯(lián)H202的工具酶及其指示反應 臨床化學測定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶等工具酶分別用于葡萄糖、尿酸的測定，

21、可使相應底物被氧化生成H202。H202主要通過以氫(或電子)為受體的指示酶和以NAD(P)H為輔酶參與的兩類指示反應進行檢測。前者主要有兩類工具酶參與反應：過氧化氫酶或稱觸酶(catalase)及過氧化物酶(peroxidase,POD)，兩者均為含三價鐵的指示酶。以指示酶POD最為常用，主要催化以下兩種反應。,一種是在POD的直接催化下，H202氧化芳香族胺色素原生成有色的色素，此類色素原供氫體有鄰聯(lián)甲苯胺(OT)、聯(lián)苯胺(DAB)

22、、鄰聯(lián)茴香胺(ODA)和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。其中只有TMB無致癌性，且其生色的靈敏度最高。,2．NAD(P)+或NAD(P)H偶聯(lián)的 脫氫酶及其指示反應 許多氧化還原反應，尤其是作為工具酶的脫氫酶如LD、GLD、G6PD等參與時，常將底物的氫原子去除后傳遞給NAD(P)+而形成NAD(P)H。LD主要以NAD+／NADH為輔酶，而GLD則不論來自肝或細菌，均可以NAD+／NAD

23、P+或其還原型為輔酶。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法進行檢測。目前利用此類反應的測定項目至少有葡萄糖、尿素、β-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD和lCD等。,為了簡化操作過程，并使酶試劑得以方便或反復使用，已有許多研究將水溶性的酶通過吸附、包埋、載體共價結合或通過酶分子間共價交聯(lián)等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，這樣制備的酶稱為固相酶(或固定酶)(

24、immobilized enzyme)。近些年來，固相酶技術發(fā)展迅速，特別是固相酶膜的應用使臨床生物化學檢驗進入了干化學的時代，一些測定變得更加方便、快速。酶電極、酶探針等也在不斷研制開發(fā)中，相信此類技術將成為臨床生物化學發(fā)展的一個新方向。,五、血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化 測定酶活性濃度方法所選擇的測定條件應是酶促反應的“最適條件”，即指在所選擇溫度下能使酶促反應的催化活性達到最大所需的條件。,最適條件主要與下述一

25、些因素有關： (1)底物、輔因子、激活劑、緩沖液和變構劑種類和濃度； (2)指示酶和輔助酶的種類和濃度； (3)反應混合液的pH和離子強度； (4)其他可變因素，如已知抑制劑的去除。 在某些情況下，為了使最終測定系統(tǒng)達到最大的測定重復性，可考慮對最適條件進行適當修改。,(一)方法選擇 應盡可能全部采用連續(xù)監(jiān)測法，少用或不用定時法。盡量減少操作步驟，以避免過多的吸量和接觸

26、太多的容器表面而引起的誤差。,(二)儀器和設備 應明確規(guī)定儀器和設備的各種性能規(guī)范，推薦使用性能符合要求或經檢定合格的分光光度計、半自動或全自動生物化學分析儀及其他相應的配套設備。任何接觸標本、試劑或反應混合物的表面都必須經化學清洗，去除干擾酶活性測定的一些物質，如極少量的酸、金屬、去垢劑或其他復合物等。,(三) 試劑 化學試劑必須具有一定純度，不含影響反應速度的雜質。試驗用水最好是純水或雙蒸水。

27、如果水中存在酶的抑制劑，其濃度應低于最小抑制濃度。如所配制試劑需保存較長時間，則應使用無菌水。選用符合臨床實驗室要求的試劑，建議用液體雙試劑。,(四)自動生物化學分析儀參數(shù)的設置 方法中應詳細列出測定酶催化濃度的全部操作過程。可參考儀器及試劑給出的方法和參數(shù)進行設置。,1．方法類型 定時法或連續(xù)監(jiān)測法。反應方向分正向／向上／+(吸光度增加)或負向／向下/-(吸光度減低)。如ALT、AST測定選用負向反應。

28、,2．波長 選擇酶促反應體系吸光度最大的波長，如用雙波長應寫明主波長／次波長。因雙波長能有效消除干擾的影響，故常被采用。,3．樣品量與試劑量 應考慮測定的靈敏度和測定上限選用合適的樣品與試劑體積比。一般推薦樣品與試劑體積比為1：10。如樣品所占比例過小會降低靈敏度，樣品量過大，則測定線性下降，樣品要稀釋后復檢的機會增多。,4．稀釋水量 添加樣品稀釋水的目的是為了洗出粘附在采樣針內壁上的微

29、量血清，減少加樣誤差。添加試劑稀釋水是為了避免試劑間的交叉污染。兩種稀釋水的量應在復溶試劑時按比例扣除。如用液體試劑盒時因不再加水，無法扣除稀釋水量，所以兩種稀釋水的量應盡量減少，以免試劑被過量稀釋。,5．反應時間 觀察反應進程曲線測出預孵育時間、延遲時間及連續(xù)監(jiān)測時間，求出反應線性時間范圍。線性反應時間范圍越寬者，越適用于臨床應用。,6．孵育時間 葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等都采用酶法的Tr

30、inder反應進行測定，但37℃酶反應較慢，必須測定這些酶試劑反應達到終點的時間。自動分析儀用試劑盒一般可以在全部加樣后5min內反應完全，所以應選擇分析儀的最大反應時間。,7．延遲時間 酶與底物混合后需要一定的時間讓酶被激活，直至線性反應期才能開始監(jiān)測，有的項目需要用工具酶將內源性代謝產物耗盡。一般單試劑法只需30s，常用項目中ALT、AST與CK-NAC需要特別注意。,8．監(jiān)測時間 測酶的連續(xù)監(jiān)測法至少

31、90～120s或至少4點(3個△A)，少于3個△A不能稱為連續(xù)監(jiān)測法，因為不能計算線性度(不知是否為線性反應)。監(jiān)測時間過長則容易發(fā)生底物耗盡，可測范圍變窄。,9．試劑吸光度上、下限 試劑吸光度上限為正向反應用，可參考試劑盒說明書要求數(shù)值折算成所用比色杯的光徑。如試劑盒要求上限為 0.5，比色杯光徑 0.7cm 者設置0.35。試劑吸光度下限為負向反應用。設置法同上，如ALT試劑吸光度下限為1.2。0.7cm比色杯設置0.

32、8。,10．底物耗盡限額 不同型號分析儀的設計不一樣。有的為零點與監(jiān)測第一點吸光度的差額；有的為MAX OD／MIN OD，即吸光度上升或下降至指定吸光度的數(shù)值；超過限額說明樣品的酶活性非常高，底物將要耗盡，隨后監(jiān)測的吸光度已不可靠，不打印結果而只打印出底物耗盡警號，樣品應稀釋5—10倍重測。,11．線性度 線性度百分數(shù)大，說明△A之間已不成線性；或為各個讀數(shù)點最小二乘法的均方差限額。超過限額說明底物不足，檢

33、測結果會變低，打印警號，應稀釋后重測。一般設15％，線性度限額定義見相關儀器說明書。各測試點最小二乘法的均方差限額計算法見儀器說明書。,12．試劑空白速率 試劑在監(jiān)測過程中底物自動降解得到的結果。此結果會在樣品測定結果中自動扣除。,13．線性范圍 按試劑質量而設置，超過范圍應增加樣品量或稀釋后重測。不同試劑公司的試劑質量不一，不同樣品試劑比的線性范圍也不一樣，應實測試劑盒的線性范圍。終點法可配制系列濃度的標

34、準液，按分析項目的波長、樣品量與試劑量、孵育時間，測定各濃度的吸光度，繪制標準曲線，在線性內的最高濃度為線性上限。,14．計算因子F值(或系數(shù)K) 計算方法詳見“系數(shù)K值的計算與應用”部分內容。凡屬吸光度下降的指示反應，F(xiàn)為負數(shù)，如測定NADPH為輔酶的各種還原酶。,(五)標本的采集、運輸與保存的技術誤差因素　　1．溶血 　　大部分酶在細胞內外濃度差異明顯，且其活性遠高于血清，少量血細胞的破壞就可能引起

35、血清中酶明顯升高。如紅細胞內的LD、AST和ALT活性分別較血清中高150、15和7倍左右，故測定這些酶時，樣品應避免溶血。,靜脈采血后，必須在1-2h內及時離心，將血清與血細胞、血凝塊分離，以免血細胞中的酶通過細胞膜進入血清而引起誤差。血細胞被分離后，因血中C02喪失極快，可使pH在15min內由7.4增至8.0，對堿性敏感的ACP活性因而急劇下降。應避免因抽血不當或急于分離血清而引起的體外溶血。,2.抗凝劑

36、 草酸鹽、枸櫞酸鹽和EDTA等抗凝劑為金屬螯合劑，可抑制需要Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK和5’-NT；草酸鹽既可與丙酮酸或乳酸發(fā)生競爭性抑制，又能與LD或NADH或NAD+形成復合物，從而抑制催化的還原或氧化反應。枸櫞酸鹽、草酸鹽對CP、ChE均有抑制作用；EDTA還能抑制ALP；氟化物也可抑制ChE。故用上述抗凝劑分離之血漿一般不宜做酶活性測定。,肝素是粘多糖，對ALT、AST、CK、LD和ACP無影響，適于急診時迅速

37、分離血漿進行測定，但需注意的是對CK等酶有輕微抑制作用。為避免上述影響，臨床上除非測定與凝血或纖溶有關的酶活性，一般都不采用血漿而采用血清為首選測定樣品。,3．溫度 血清蛋白對酶蛋白有穩(wěn)定作用，如無細菌污染，某些酶(如 AST、γ-GT和ALP等)存在于清蛋白中，可在室溫保存l～3天，而活性不受影響。故室溫中較穩(wěn)定的酶類甚至可快速郵件送檢；有些酶極不穩(wěn)定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50％。大部分酶在低

38、溫中比較穩(wěn)定，一般至少應在血清分離后的當天進行測定，否則應放冰箱冷藏。,通常測定酶樣品應在低溫(0～4℃)條件下使用、處理和保存，但有些酶在低溫(特別是20℃冰凍)時，可引起不可逆性失活(如ALD)。個別酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在低溫反而不如室溫穩(wěn)定，即所謂“冷變性”。用液氮貯樣法保存人的血清于-195℃中，常用診斷酶ALT、AST、ALP、CK、LD、γ-GT和AMY活性，在10個月后活性基本無明顯改變。可作為酶學測定用血

39、清標本及質控品長期保存的方法。,六、酶活性濃度的單位(一)酶活性單位 1．慣用單位 二十世紀50年代以前酶活性單位命名混亂，常用首先報告該種酶測定方法的臨床酶學家的名字來命名其單位，不僅酶不同，單位不同，即使是同一種酶也因方法不同而可有數(shù)種活性單位，參考值差別也很大，既引起混亂，又不便于互相進行比較，給臨床實際工作帶來很大不便。,2．國際單位 1963年國際酶學委員會推薦采用國際單位來統(tǒng)一表示酶活性的大小，即在25

40、℃及其他最適條件下，每分鐘能催化一微摩爾底物轉變的酶量為一個國際單位。 到1976年對酶活性單位的定義為：在特定的條件下，一分鐘內使底物轉變一微摩爾的酶量為一個國際單位。以IU表示之，IlU=1μmol·min-1。由于未指定酶反應溫度，目前國內外大多數(shù)臨床實驗室常省略國際二字，即常將IU簡寫為U。,3．Katal單位 1979年國際生物化學協(xié)會為了使酶活性單位與國際單位制(S1)的反應速率相一致，推薦用

41、Katal單位(也稱催量，可簡寫為Kat)。即在規(guī)定條件下，每秒鐘催化轉化一摩爾底物的酶量。lkatal=lmol·s-1。我國法定計量單位制中的酶催化活性單位為katal，其對血清中酶量而言顯然過大，故常用單位為μkatal或nkatal。lkatal=60x 106 U，1U=1μmol· min-1=16.67nmol·s-1=16.67nkatal。,(二)酶活性濃度單位 臨床上測定的不是酶的

42、絕對量而是濃度。酶活性濃度以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。1．表示方法 目前在臨床化學中，各國學者幾乎都習慣用U／L來表示體液中酶催化濃度。,2．酶活性濃度單位的計算 可根據所測定的酶所用方法的不同，利用標準管法、標準曲線法或摩爾消光系數(shù)法進行計算求取酶活性濃度單位。前兩種方法目前已較少使用。,用連續(xù)監(jiān)測法進行酶活性測定時，不需作標準管或標準曲線，根據摩爾消光系數(shù)很容易進行酶活性濃度的計算。摩爾消光系數(shù)(ε)的定義為

43、：在特定條件下，一定波長的光，光徑為1.00cm時，通過所含吸光物質的濃度為1.00 mol／L時的吸光度。如用連續(xù)監(jiān)測法測定在線性范圍內每分鐘吸光度的變化(△A／min)，以U／L表示酶活性濃度時，則可按下式進行計算： U/L=,式中：V一反應體系體積(ml) ε一摩爾消光系數(shù)(cm2·mol-1) v一樣品量(ml) L一比色杯光徑(cm) △A一吸

44、光度變化 106一將mol換算成μmol,(三)參考值和正常上限倍數(shù)的應用 1．參考值 由于臨床實驗室進行酶學測定時所選儀器、試劑和方法不同，加之生物學變異等對酶活性影響，常常導致實驗室之間所得參考值差別甚遠，應根據各自情況對各種酶建立自己的參考值。對儀器廠家所提供的資料、市售試劑盒的說明書等所給出的參考數(shù)值，都應經過實際驗證和統(tǒng)計學處理，方能決定是否采用，切莫輕易加以接受。表6-6列舉了幾種臨床常用酶的成人參考值。,2

45、．正常上限倍數(shù)的應用 近來有不少學者建議，在分析酶學報告時，不應局限傳統(tǒng)測定的報告方式(U／L)，而改以正常上限(upper limits of normal，ULN)倍數(shù)作為酶活性濃度的表示法。,所謂正常上限倍數(shù)是指把酶測定值轉換為正常上限值的倍數(shù)。簡單地說，就是測定值除以正常上限值。不難發(fā)現(xiàn)，使用不同的方法、其單位、測定值和參考值均不一致，在解釋來自不同方法的結果時，幾乎很難看出其間確實有差異，但如果將各測定值分別轉

46、換成ULN值，則比較容易多了。,由于酶學測定中，一般以酶增加的異常較多，故不取正常下限值作為倍數(shù)指數(shù)。如將ULN進一步適當分級，制定出輕度、中度及極度增加的范圍，則更一目了然。有些酶測定要考慮到不同性別、年齡時間時，用ULN換算更能正確表達，就不致發(fā)生誤判。,七、系數(shù)K值的計算與應用 在實際工作中，特別是用自動生物化學分析儀測定同一酶，條件固定時，從理論上來講V、v和L均為固定值，ε為常數(shù)，則將上述公式可簡化為：,,一般稱K為

47、酶活性濃度定量系數(shù)(或稱為常數(shù))，主要用于臨床酶活性測定的計算與校正。例如連續(xù)監(jiān)測法測定血清中LD活性濃度，已知NADH的ε為6.22x103cm2·mol-1，血清量為50ul，底物液為1ml，比色杯光徑為lcm，則K=1.05x106／6.22x103x0.05xl=3376。,ε,(一)系數(shù)K值的意義與設置 系數(shù)K值對于酶的測定十分重要，過高雖然測定的線性較寬，但重復性差，反之，雖然精密度好，但檢測線性

48、窄。因此，應根據實際情況進行合理的設置與應用。K值的設置應考慮測定酶的參考值上限及測定時間兩方面，以保證測定結果的可靠。這些都與儀器測定的噪音(noise)有關。,一般而言, 自動分析儀吸光度噪音都需控制在0.001，也就是儀器保證對同一溶液反復測定時，吸光度誤差控制在0.001左右。如K值為8 000，每分鐘測定吸光度如有0.001微小變化，根據上式，結果將出現(xiàn)8U／L左右的誤差，這對于一些參考值較低的酶如轉氨酶來說顯然太大。,此外，

49、如果測定時間由1min延長到2min，此時0.001噪音對每分鐘測定吸光度誤差將減小一半，也就是說，K值可以設置大一些。但如果測定時間只有0.5min，K值一般不超過4000。改變K值最簡單的方法就是改變標本的稀釋度，稀釋倍數(shù)越大，K值越大。,(二)系數(shù)K值的類型與計算 在連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性的試劑中，一般標明指示物的理論ε。臨床實際工作中，儀器諸多因素如波長的準確性、半波寬的大小，比色池光徑及磨損與清潔度，溫控的準確

50、性，加樣系統(tǒng)狀況等若不符合要求或發(fā)生變化都會影響指示物的ε值或上述公式中的有關項。因此，應在具體儀器條件下，定期檢查和實際測定指示物的ε和系數(shù)K值(即儀器實測K值)。,340nm干涉濾光片的NAD(P)H的ε可用葡萄糖的己糖激酶法實測，即對已知濃度的葡萄糖標準品進行終點法測定，產生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD(P)H，計算其實測的ε，再計算實測K值。光柵式可直接使用文獻或試劑盒說明書的數(shù)值。,NAD(P)H為指示酶的雙波長(340nm／3

51、80nm)檢測法有兩種類型：　?、俅尾ㄩL只用于減去血清的濁度與色素(只測一次)，連續(xù)監(jiān)測法只讀主波長的吸光度，可直接用文獻數(shù)值；　　②連續(xù)監(jiān)測法全程用雙波長讀吸光度，由于NAD(P)H在次波長有吸光度，所以要用主波長的ε減去次波長的ε來計算系數(shù)K值。,八、臨床酶學測定的標準化 　　測定酶活性濃度受諸多因素影響，如樣品的采集與貯存，所用儀器與試劑的復雜多樣，測定方法條件的差異等。為了提高酶學測定的準確性和精密度，使酶測定結果

52、在方法間、實驗室間有可比性，消除參考值的混亂，以利于臨床應用，開展酶學測定的標準化工作勢在必行。,(一)標準化途徑 　　1.使用推薦方法和參考方法 推薦方法的使用，使各實驗室間對同一種酶的測定結果具有可比性、可轉換性(commutability)。我國于1994年發(fā)表了《測定人血清(血漿)中酶催化濃度方法總則》，并于1995年、1996年相繼通過了ALT、γ-GT、CK、LD、ALP、AST等6項推薦方法草案。,2．使

53、用公認的酶校正物或酶參考物 酶測定中最理想的校正方法是用穩(wěn)定的定值準確的酶校正物或酶參考物對測定全過程進行校正。 目前國內外推薦有證參考物(certified reference material，CRM)、標準參考物(standard referencematerial，SRM)和酶參考物(ERM)用于酶學測定的校正。這些物質的定值可溯源到各自的參考方法或推薦方法，能用于校正一個或多個常規(guī)方法。酶校正物的

54、使用可改進方法間的符合程度，增加常規(guī)酶測定方法的可靠性。,(二) 全球參比體系 IFCC于1998年決定建立包括下列要素的測定酶催化濃度的全球參比體系： 1．參考測定方法 以原有的30℃的參考方法作為基礎，制定了一套37℃的標準操作方法(SOPs)。IFCC于2002年發(fā)表了關于酶催化濃度的原級參考方法總則及CK、LD、ALT、AST和γ-GT的SOPs。,2．參考實驗室網絡

55、 選擇一組參考實驗室包括廠家實驗室，為之提供必要的技術和儀器，使之在計量學高水平上按參考測定方法(SOPs)進行測定。,3．參考物 參考實驗室網絡對現(xiàn)有的BCR參考物進行重新認證。 根據“對校正物和質控物的酶催化濃度指定值的計量溯源”標準，酶的測量值由原級參考方法來確定，包括以下方面詳細的規(guī)定，即底物的種類及其濃度、緩沖液成分、pH、效應物及其濃度、催化反應的方向、指示物成分、溫度、孵育時間、延滯