聚乳酸生物降解酶及其催化特性研究.pdf

1、石油基塑料作為材料產(chǎn)業(yè)的一大支柱，已經(jīng)成為社會(huì)生活不可或缺的一部分，但隨著白色污染的嚴(yán)重及石油資源的日益匱乏，其地位明顯動(dòng)搖，綠色高分子材料逐步受到青睞。目前開(kāi)發(fā)的綠色高分子材料主要是聚酯類，其優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在具有生物可降解性和可再生性；而且，天然的或經(jīng)過(guò)改性的聚酯具有和傳統(tǒng)塑料相當(dāng)甚至更優(yōu)的機(jī)械性能和物理化學(xué)性能，能夠滿足人們社會(huì)生活的需求，其中聚乳酸(PLA)以其優(yōu)良的物理化學(xué)性能和潛在的成本優(yōu)勢(shì)尤受人們的關(guān)注。目前相對(duì)于其它高分子材料，

2、PLA已經(jīng)以其性能和成本優(yōu)勢(shì)率先實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，成功地應(yīng)用于醫(yī)療、紡織和包裝等產(chǎn)業(yè)，被認(rèn)為是最具潛力的替代現(xiàn)有塑料的新型“生態(tài)材料”之一。 雖然PLA在性能和生產(chǎn)應(yīng)用上與其它聚酯相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但其生物降解的研究卻相對(duì)滯后。PLA在自然界中降解緩慢，發(fā)現(xiàn)的降解微生物和高效降解酶有一定的特殊性，這限制了針對(duì)PLA廢棄物處理回收系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，而沒(méi)有成功的回收系統(tǒng)將無(wú)法實(shí)現(xiàn)PLA生產(chǎn)的物料循環(huán)。目前PLA的降解機(jī)理尚未闡

3、明，這在很大程度上限制了可控降解材料的開(kāi)發(fā)，也限制了PLA材料的推廣和應(yīng)用，只有強(qiáng)化PLA的快速降解性和完全降解性機(jī)理的研究，才能夠真正實(shí)現(xiàn)其環(huán)境友好化。因此，本文從PLA降解菌株出發(fā)，研究了PLA降解酶的性質(zhì)及催化特性，從酶催化機(jī)理及進(jìn)化分析的角度對(duì)PLA的降解機(jī)制進(jìn)行了探討。 本文主要的工作內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.通過(guò)對(duì)土壤樣品和菌種庫(kù)菌種的篩選，獲得了一株高效降解PLA的菌株——Amycolatopsis ori

4、entalis。 自然界中降解PLA的菌株十分有限，主要集中在稀有放線菌中。本文通過(guò)土壤和菌種庫(kù)的篩選獲得了對(duì)PLA具有降解作用的菌株，并以其中降解能力相對(duì)高效的.Amycolatopsis orientalis為研究對(duì)象，進(jìn)行了降解性能的評(píng)價(jià)和表征，證實(shí)該菌株可以以PLA為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，吸收降解產(chǎn)物乳酸。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株分泌產(chǎn)生誘導(dǎo)型的PLA降解酶，除了PLA以外，蛋白類物質(zhì)(明膠、蠶絲、蛋白胨等)也可以高效的誘導(dǎo)

5、PLA降解酶的產(chǎn)生，推測(cè)降解酶與蛋白酶類存在著一定的相關(guān)性。通過(guò)比較，確定選擇明膠為最佳誘導(dǎo)物進(jìn)行下一步的誘導(dǎo)產(chǎn)酶。 2.從Amycolatopsis orientalis發(fā)酵液中同時(shí)分離到了三種對(duì)PLA具有高效降解作用的降解酶。 目前國(guó)際上報(bào)道的從聚乳酸降解菌株中分離得到的降解酶只有3個(gè)，并且均為單酶組分。本文首次利用離子交換、疏水層析、分子篩層析等分離方法從Amycolatopsis orientalis發(fā)酵液中分離到了三

6、種對(duì)PLA具有高效降解作用的降解酶，并對(duì)其催化特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。研究發(fā)現(xiàn)三種降解酶的分子量分別為24.0、19.5和18.0 kDa，且均為堿性蛋白?；钚员容^及動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析都顯示出這些降解酶對(duì)PLA的降解活性均比PLA的代表性降解酶-蛋白酶K要高。除了對(duì)PLA具有降解作用以外，這些PLA降解酶對(duì)蛋白及小肽類物質(zhì)也都具有降解活性，且受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的強(qiáng)烈抑制，從催化特性上分析該酶可能屬于絲氨酸蛋白酶。MALDI-TOF肽

7、指紋圖譜分析結(jié)果顯示，三個(gè)降解酶的胰酶酶解峰各不相同，可能不是來(lái)源于同一前體，而是獨(dú)立的降解酶組分；質(zhì)譜結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)沒(méi)有找到匹配程度較高的蛋白，暗示這些降解酶可能是沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)研究的新的酶類。 3.利用降解酶生化信息克隆到兩個(gè)PLA降解酶基因，并初步實(shí)現(xiàn)了其異源表達(dá)。 目前僅有兩篇文章報(bào)道了PLA降解酶基因的相關(guān)信息，一篇是通過(guò)基因組文庫(kù)進(jìn)行功能篩選獲得其基因，另一篇是通過(guò)對(duì)降解酶進(jìn)行有限酶解后測(cè)序設(shè)計(jì)相應(yīng)探針從

8、基因組文庫(kù)中獲取相關(guān)基因。本文根據(jù)降解酶具有絲氨酸蛋白酶的生化性質(zhì)，推測(cè)其具有保守的絲氨酸位點(diǎn)，根據(jù)保守位點(diǎn)序列及酶的N端測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增部分基因序列，然后通過(guò)一種新興的染色體步移技術(shù)--SEAF-PCR克隆全長(zhǎng)基因，獲得了兩個(gè)降解酶PLAaseⅡ和PLAaseⅢ的基因序列；同時(shí)，將PLA降解酶基因分別在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了具有活性的重組表達(dá)蛋白，初步建立了PLA降解酶的表達(dá)體系，從而為深入精細(xì)地研究其

9、功能機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 4.序列比對(duì)及同源模建揭示了PLA降解酶結(jié)構(gòu)的特殊性。 通過(guò)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)及一系列生物信息學(xué)軟件對(duì)降解酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，PLAase2和PLAase3屬于絲氨酸蛋白酶家族的SlA亞族，具有絲氨酸蛋白酶的保守結(jié)構(gòu)域，三聯(lián)體活性中心并未發(fā)生明顯變化，分別對(duì)應(yīng)于PLAase2的H71、D103、S190和PLAase3的H32、D58、S135；而且其整體結(jié)構(gòu)也和蛋白酶家族中的其它酶一樣具有兩

10、個(gè)β桶結(jié)構(gòu)域，活性中心處于兩個(gè)桶之間的裂縫中；對(duì)胰凝乳蛋白酶極性環(huán)境的穩(wěn)定性和氧負(fù)離子洞形成十分重要的S214殘基和G193殘基也都存在，分別對(duì)應(yīng)于PLAase2中的S215、G188和PLAase3中的S150、G133。但PLAase2和PLAase3的底物結(jié)合口袋具有明顯的特異性，關(guān)鍵的216位和226位氨基酸與家族中其它成員的不同；被認(rèn)為在P1口袋處形成二硫鍵為洞穴提供剛性的C191和C220，及包含了Ca結(jié)合位點(diǎn)E70和E80

11、殘基，在PLAase2和PLAase3中都不存在。這些結(jié)果暗示可能正是-由于這些差異性導(dǎo)致了PLAase2和PLAase3結(jié)構(gòu)與其它絲氨酸蛋白酶的不同，其P1結(jié)合口袋可能具有更大的柔性從而造成了特殊的底物特異性，使降解酶更容易與PLA結(jié)合。同時(shí)本文利用Insightll模建軟件，對(duì)PLAase2和PLAase3及目前NCBI中收錄的PLA降解酶序列進(jìn)行了同源模建，結(jié)果顯示這些PLA降解酶在骨架結(jié)構(gòu)上與模板酶沒(méi)有明顯的差別，發(fā)生變化的部分

12、主要在于S1底物結(jié)合口袋及表面的loop區(qū)，而這些位置已經(jīng)被證明與酶的底物特異性密切相關(guān)，因此推測(cè)這些區(qū)域可能是使PLA降解酶具有特殊活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。另外，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析還顯示出，這些降解酶只與高GC含量的革蘭氏陽(yáng)性菌的絲氨酸蛋白酶同源性較高(50％左右)，除保守位點(diǎn)外，其它區(qū)域序列與家族中其它成員相比相似性很低，推測(cè)PLA降解酶處于獨(dú)特的進(jìn)化地位，具有“古老”的蛋白酶骨架，而催化活性相關(guān)部位具有較高的可塑性。對(duì)PLA降解酶系統(tǒng)的深入研

13、究對(duì)于揭示這一類特殊酶的功能和進(jìn)化地位具有重大意義。 5.對(duì)降解酶降解PLA的機(jī)制進(jìn)行了探討。 基于上述分析結(jié)果，對(duì)PLA的降解機(jī)制進(jìn)行了探討，提出了PLA與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的類似性為PLA的降解提供了充分條件；特殊酶的存在是PLA降解的必要條件。推測(cè)這類降解酶對(duì)PLA具有降解作用不只因?yàn)槠渚哂械鞍酌副Ｊ氐幕钚晕稽c(diǎn)，更關(guān)鍵的在于其底物結(jié)合口袋及表而loop區(qū)的特殊性，使酶具有了更為廣泛的底物特異性，從而能夠?qū)LA進(jìn)