水華微囊藻分離及其鑒定技術研究進展

1、水華微囊藻分離及其鑒定技術研究進展水華微囊藻分離及其鑒定技術研究進展聶晶晶聶晶晶1，鐵程，鐵程2，金玉，金玉2，殷麗萍，殷麗萍2，李元，李元1，楊良，楊良2摘要：我國是藍藻水華分布最廣，受影響最大的國家之一。水華的普遍發(fā)生，使水體的感官性狀惡化，水體自凈能力降低。有毒藍藻的研究也是目前熱點之一；微囊藻毒素(Microcystins，MC)是一種在藍藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素種類。對其研究十分必要。但在微

2、囊藻分離培養(yǎng)以及分離后純種的鑒定研究方面還存在許多難點。本文介紹近幾年來在水華藍藻分離培養(yǎng)和鑒定技術方面的研究進展。關鍵詞：分子鑒定藍藻水華分離培養(yǎng)前言：湖泊、水庫和河流中接納過多的氮和磷等營養(yǎng)物質，使水體的生態(tài)結構與功能發(fā)生變化，導致藻類特別是藍藻(Cyanobacteria)的異常繁殖生長而出現(xiàn)的藍藻水華現(xiàn)象。當藍藻水華嚴重時，水面形成厚厚的藍綠色湖靛，散發(fā)出難聞的氣味。不僅影響人的感官、破壞了健康平衡的水生生態(tài)系統(tǒng)，而且因藻細胞破

3、裂后釋放出了多種藻毒素而對人和動物的飲用水安全構成了嚴重的威脅。世界上25％～70％的藍藻水華污染可產(chǎn)生藻毒素，在已發(fā)現(xiàn)的各種不同藻毒素中，微囊藻毒素(Microcystins，MC)是一種在藍藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素種類。純種藻的分離和培養(yǎng)十分必要，然而藻類的分離培養(yǎng)有很多因素制約，如藻細胞普遍比較小，而且很多藻細胞聚集在一起也對分離造成了很多的困難。很多科研單位從藻種提供單位購買，不僅增加了研究支

4、出，而且特異性的地區(qū)藻類的進化和遺傳有很大差異。科研單位有必要獨立解決藻類的分離培養(yǎng)技術。分離培養(yǎng)的純種藻需要定性說明是什么藻，所以藻的鑒定也是十分必要的。1.藻類分離培養(yǎng)藻類的分離方法就是為了提供純種藻作為基礎和應用研究的材料，也是今后開展藻類增長潛力試驗(簡稱AGP試驗)不可缺少的手段之一。藻類培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個體分離出來，而獲純種培養(yǎng)。這種方法稱為藻種分離和純化，又稱純培養(yǎng)法。真正的

5、“純種培養(yǎng)”是指在排除包括細菌在內的一切生物的條件下進行的培養(yǎng)。這是進行科學研究不可缺少的技術，而在生產(chǎn)性培養(yǎng)中不排除細菌的稱之為“單種培養(yǎng)”。要想從水體中分離出試驗所需的純種藻必須經(jīng)預備培養(yǎng)；藻種分離；純種培養(yǎng)；保種這四個步驟。1.1藻種分離細胞藻類的分離方法按照培養(yǎng)載體分為：固體培養(yǎng)基法、液體培養(yǎng)基法。1.1.1固體培養(yǎng)基法(1)半固體稀釋倒平板法：先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋，然后分別取不同稀釋液少許，與已溶化并冷卻至3

6、5℃左右的瓊脂培養(yǎng)基（200mL培養(yǎng)基加入0.5g瓊脂）混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含藻的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一段時間后可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當，在平板表面或者瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個藻種，然后挑取該單個藻株，或重復以上操作數(shù)次，便可得到純的單種藻。(2)涂布平板法[1]：2.1保種保種為了保證分離出來的單細胞藻種的成活，需定期將它移入新的培養(yǎng)液中，待藻種在新的培養(yǎng)液中長成后，便可將它放在低溫、弱光下保

7、存。保種時需要注意防止藻液污染。通常用液體培養(yǎng)基保存藻種接種一次只能保存1～2個月，而用固體培養(yǎng)基保存藻種接種一次可以保存半年到一年。保種用的固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)物濃度應高于液體培養(yǎng)液，一般可增加一倍。瓊脂量為1％～15％而且現(xiàn)在對于藻類也可適當?shù)臏p少瓊脂量，使其制成半固體培養(yǎng)基，實踐中也獲得不錯的效果。2.2大量培養(yǎng)微囊藻培養(yǎng)包括接種、培養(yǎng)、采收等。（1）接種：一般要求選取生活力強、生長旺盛藻種?？上葘饪s藻種用連續(xù)稀釋法，制備一定濃度的

8、懸浮藻液，然后接入培養(yǎng)容器。接種時注意藻種和培養(yǎng)液比例要適當，使藻細胞在新培養(yǎng)液中達到一定數(shù)量。使一開始培養(yǎng)，藻類在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢，另一方面還可縮短培養(yǎng)周期，這是培養(yǎng)得到成功的經(jīng)驗之一。在環(huán)境條件不很適合情況下，更需提高接種量。一般所用藻種濃度，根據(jù)藻類體積大小，每毫升30萬～300萬個，采用1∶2～1∶5的比例。還需注意接種時間，在自然光條件下，最好在上午8～10時，不宜在晚上。（2）培養(yǎng)管理：主要是使已接種培養(yǎng)物在相對穩(wěn)定適宜環(huán)境中

9、大量繁殖生長。要注意以下因素：1）二氧化碳濃度：在開放式不通氣方法培養(yǎng)中，攪拌是十分必要的，可以增加水和空氣的接觸面，使空氣中二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，而且?guī)椭恋碓孱惣毎细～@得光照。在通氣培養(yǎng)中，培養(yǎng)液內應維持二氧化碳濃度在0.1～5％之間。2）光照強度：利用太陽光源培養(yǎng)時，一般在室內培養(yǎng)可放在近窗口地方，防止強直射光照射或利用人工光源（60～100Ｗ電燈或日光燈），需1500～3000Ix。3）溫度：適溫一般在10～30℃之間，最適

10、溫常為20～25℃。若在室外培養(yǎng)，夏季中午高溫，冬季早晚低溫，常造成不利影響，需設法調節(jié)。4）無機營養(yǎng)：應不斷添加新鮮培養(yǎng)液，及時補充被藻吸收后減少了的某些元素。5）注意pH變化：變動過大，可用酸、堿調節(jié)。6）適當控制培養(yǎng)物中藻細胞濃度：過高會引起光照和無機營養(yǎng)不足，并導致pH上升。一般控制在0.3g（干重）L范圍內。7）及時觀察和檢查藻類生長情況：可以通過培養(yǎng)物呈現(xiàn)的顏色、藻類細胞運動情況、是否有沉淀附壁、菌膜及敵害生物污染跡象等觀察

11、而了解一般的生長情況。藻種培養(yǎng)每半月進行一次全面顯微鏡檢查。大量培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有不正?，F(xiàn)象，應立即鏡檢，目的有兩個：了解藻細胞生長情況，并檢查有無污染。（3）采收：通常在培養(yǎng)物細胞濃度達到干重0.4～0.5克升時，即可采收培養(yǎng)總量13的藻體。采收時，先攪拌培養(yǎng)物，取出13量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明礬或6％飽和石灰水。約1～2小時，藻細胞即可完全沉淀，取出沉淀，離心、濃縮、凍干。3.微囊藻鑒定方法藻類在監(jiān)測湖泊、水庫等水體的水質狀