寬體沙鰍精子主要生物學(xué)特性及活力的觀察

1、寬體沙鰍精子主要生物學(xué)特性及活力的觀察摘要：為提高寬體沙鰍reevesae)reevesae)人工繁殖過程中精子的活力及印子的受精率，本文研究了寬體沙鰍精子的形態(tài)、密度、pHpH值以及不同水體、pHpH和激活介質(zhì)對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響。結(jié)果顯示：寬體沙鰍精子由頭部、中片及尾部三部分構(gòu)成。頭部短徑(2.181(2.1810.148)pm0.148)pm，長(zhǎng)徑(2.525(2.5250.197)0.197)嘩。中片甚短，光鏡下很難辨清。尾

2、部長(zhǎng)(31.905(31.9052.869)2.869)；精子密度為(1.443(1.4430.292)x100.292)x101010indmlindml；pHpH6.77.06.77.0；精子活力以井水中最高，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間，有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別為(8.82(8.820.97)s0.97)s、(15.13(15.131.18)s1.18)s和(35.71(35.712.90)s2.90)s；以pHpH為7.57.5的曝氣去離子水中

3、活力最強(qiáng)，精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間，有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別為(11.91(11.911.66)s1.66)s、（14.8714.871.94)s1.94)s和(38.34(38.341.67)s1.67)s；精子生存的最適Na濃度為75mmolL，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間，有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別為(23.733.06)s、（37.454.43)s和(98.938.78)s；最適K濃度為0.5mmolL，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間，有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別為（17.6

4、51.56)s、(26.051.86)s和(52.782.96)s；最適Ca2濃度為5mmolL，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間，有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別為(12.750.74)s、（19.610.99)s和(57.258.60)s=.結(jié)論：寬體沙鰍精子激活介質(zhì)宜采用井水配置，pH為7.5，以NaCl、KCl和CaCl2濃度分度分別為別為75mmolL、0.5mmolL和5mmolL作為激活介激活介質(zhì)，效果最佳。建，效果最佳。建議實(shí)議實(shí)際生產(chǎn)中選取合適取

5、合適的激活介的激活介質(zhì)并質(zhì)并采用一雄多雌的方式采用一雄多雌的方式進(jìn)行人工受精。行人工受精。關(guān)鍵詞：寬體沙鰍(Sinibotiareevesae)；精子形態(tài)；精子活力；精子壽命1前言魚類精子質(zhì)量是影響繁殖效果的重要因素，其評(píng)價(jià)指標(biāo)有形態(tài)、密度、pHpH和精子活力等[1]。其中精子活力是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量最重要指標(biāo)，與受精率成顯著正相關(guān)[2][2]。許多研究表明，魚類精子生理特性與環(huán)境長(zhǎng)期相互適應(yīng)導(dǎo)致了魚類精子的激活與抑制同環(huán)境鹽度、pHpH值、

6、溫度、滲透壓、離子、激素及季節(jié)變化等因素有關(guān)[3]。寬體沙嫩寬體沙嫩(Siraboia(Siraboiareevesae)reevesae)隸屬趣形目隸屬趣形目(Cyprinifmes)(Cyprinifmes)嫩科嫩科(Cobitidae)(Cobitidae)沙嫩亞科沙嫩亞科(Botiinae)(Botiinae)，是長(zhǎng)江上游，是長(zhǎng)江上游特有魚類。目前有關(guān)寬體沙鰍的研究主要集中在胚胎發(fā)育及人工繁殖方面，對(duì)其精子形態(tài)、密度、pHpH及

7、活力等方面的評(píng)價(jià)研究甚少。本文對(duì)寬體沙鰍精子的形態(tài)、密度、pHpH及不同水體、不同pHpH和不同濃度NaNa、K、CaCa2離子溶液對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響進(jìn)行了研究，旨在為寬體沙鰍繁殖生物學(xué)及大規(guī)模人丁繁殖提供基礎(chǔ)資料。2材料和方法2.12.1材料材料實(shí)驗(yàn)所用寬體沙鰍由長(zhǎng)江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。選取3030尾健康的性成熟雄魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，體重(12.42(12.420.58)g0.58)g，體長(zhǎng)(88.33(88.3

8、33.92)mm3.92)mm。2.22.2方法方法2.2.12.2.1精液采集精液采集用吸水紙或干毛巾吸干雄魚生殖孔表面及周圍的水分并擦凈，由前往后輕壓魚腹兩側(cè)獲得精液。用預(yù)備好的干燥潔凈的載玻片接取精液，置于冰浴中備用。要求精液乳白色、粘稠、無水、無血、無尿、無糞便，遇水后能迅速散開。測(cè)定精子活力實(shí)驗(yàn)過程中，采集的精液樣品應(yīng)至少20mm20mm更換一次，避免在空氣中長(zhǎng)時(shí)間暴露失活的精子影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4][4]。2.2.2精子形態(tài)觀察

9、及密度、pHpH值的測(cè)定用100mmolL100mmolLNaClNaCl溶液稀釋新鮮精液，移液槍吸取適量懸液涂片，風(fēng)干，甲醇固定，經(jīng)H.EH.E染色、脫水、透明后，以中性樹膠封片，MoticMoticBA210BA210顯微鏡下觀察。拍照并測(cè)定精子頭部短徑、長(zhǎng)徑和尾長(zhǎng)，共2020組，結(jié)果用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。用2.5%2.5%戊二醛(0.2M(0.2M磷酸緩沖液50ml50ml，25%25%戊二醛溶液10ml10ml，雙蒸水100ml)

10、100ml)固定新鮮精液，將精液稀釋為1%1%，輕微搖勻。取用血球計(jì)數(shù)板(XBK25)(XBK25)在MoticBA210MoticBA210顯微鏡(100x)(100x)下計(jì)數(shù)，求出精子密度，重復(fù)1010次，結(jié)果用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。用精密pHpH試紙(B(B廣泛試紙，上海三愛思試劑有限公司，pHpH范圍114)114)測(cè)定新鮮精液的pHpH。2.2.32.2.3實(shí)驗(yàn)液的配制2.2.3.12.2.3.1不同水體準(zhǔn)備不同水體準(zhǔn)備采集江水采

11、集江水(采自沱江采自沱江內(nèi)江段；溶氧內(nèi)江段；溶氧8.13mgLpH8.13mgLpH6.066.06；14.714.7C)C)、井水井水(溶氧溶氧12.24mgLpH12.24mgLpH6.826.82；13.513.5C)C)、曝氣蒸餾水曝氣蒸餾水(溶氧溶氧7.85mgL7.85mgLpHpH6.436.43；14.014.0C)C)和曝氣自來水和曝氣自來水(溶氧溶氧7.95mgL7.95mgLpHpH6.796.79；13.413.

12、4C)C)來測(cè)定不同來測(cè)定不同水體對(duì)寬體沙鰍精子活力及壽命的影響。水體對(duì)寬體沙鰍精子活力及壽命的影響。2.3.3.22.3.3.2不同不同pHpH試驗(yàn)液配制試驗(yàn)液配制用1%1%NaOHNaOH溶液和溶液和1%1%HClHCl溶液調(diào)節(jié)曝氣去離子水，配制溶液調(diào)節(jié)曝氣去離子水，配制8個(gè)pHpH梯度的試驗(yàn)液：梯度的試驗(yàn)液：5.55.5、6.06.0、6.56.5、7.07.0、7.57.5、8.08.0、8.58.5和9.09.0。2.3.3.

13、32.3.3.3不同陽離子試驗(yàn)液的配制設(shè)置3種不同陽離子試驗(yàn)液，每種試驗(yàn)液用曝氣去離子水配制6個(gè)濃度梯度：1)NaClNaCl溶液：溶液：0mmolL0mmolL、10mmolL10mmolL、25mmolL25mmolL、50mmolL50mmolL、75mmolL75mmolL和100mmolL100mmolL。2)KClKCl溶液：溶液：0.1mmolL0.1mmolL、0.3mmolL0.3mmolL、0.5mmolL0.5mm

14、olL、0.7mmolL0.7mmolL、0.9mmolL0.9mmolL和1.0mmolL1.0mmolL。3)CaClCaCl2溶液：溶液：1mmolL1mmolL、3mmolL3mmolL、5mmolL5mmolL、10mmolL10mmolL、15mmolL15mmolL和20mmolL20mmolL。2.2.42.2.4精子活力的觀察參照魯大椿的方法[5][5]將寬體沙鰍精子的運(yùn)動(dòng)分為快速運(yùn)動(dòng)、中速運(yùn)動(dòng)、慢速運(yùn)動(dòng)和原地顫動(dòng)4個(gè)

15、階段。時(shí)期的劃分以視野中有70%70%左右精子由尾部線性長(zhǎng)尾部線性長(zhǎng)(31.905(31.9052.869)2.869)。精子。精子6060r圖1寬體沙鰍精子(HE(HE染色）Fig.1Fig.1Sinibotiareevesaespermsperm(hem(hematoxylinatoxylineosineosinstaining)staining)H代表頭部，代表頭部，M代表中片，代表中片，F(xiàn)代表尾部代表尾部Hstsstsffhea

16、dhead，Mstsstsffpiecepiece，F(xiàn)stsstsffflagflag3.23.2不同水體對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響不同水體對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響由圖2可見，寬體沙鰍精子有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命在井水中均為最長(zhǎng)，分別為(15.13(15.131.18)s1.18)s和(35.71(35.712.90)s2.90)s。有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別在蒸餾水和江水中最短。單因素方差分析，DuncanDuncan多重檢驗(yàn)顯示:寬體沙鰍精子的

17、有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命在井水與在其它三種水質(zhì)之間存在極顯著差異(P0.01)(P0.01)。其余各組間均存在顯著差異(P0.05)(P0.05)。圖2不同水體對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響不同水體對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響Fig.2Fig.2TheTheeffectioneffectionofofSinibotiareevesaespermsperminindiversediverseaqueousaqueoussolutionsolution3.

18、33.3不同不同pHpH值對(duì)精子值對(duì)精子活力的影響活力的影響由圖3可見，在pHpH5.59.05.59.0的范圍內(nèi)，精子均可以存活，在pHpH7.57.5時(shí)活力達(dá)到最高，此時(shí)的有效運(yùn)動(dòng)???#lOftm(2.181(2.181士0.148)0.148)阿，長(zhǎng)徑阿，長(zhǎng)徑(2.525(2.525士0.197)gm0.197)gm中片淺紅色較短不易觀察中片淺紅色較短不易觀察密度密度(1.443(1.4430.292)xl00.292)xl01