中醫(yī)課題標(biāo)書

1、附件2省中醫(yī)藥科技計劃項目申請書2008yA006項目名稱：溫補腎陽法對哮喘小鼠骨髓CD34祖細(xì)胞分化的干預(yù)研究（此頁不可另行附頁）三、項目研究前景分析三、項目研究前景分析（包括國內(nèi)外同類項目研究現(xiàn)狀，市場需求情況，研究開發(fā)意義，可附主要參考文獻(xiàn)）支氣管哮喘(哮喘)是一種以嗜酸粒細(xì)胞(Eos)浸潤為主的氣道反應(yīng)性炎癥和以氣道高反應(yīng)性(airwayhighreaction，AHR)為特征的疾病。當(dāng)今世界上約有1.6億哮喘病患者，發(fā)病率呈逐

2、年增長趨勢。但其發(fā)病機制尚未完全明確。目前認(rèn)為，氣道炎癥是哮喘AHR的基礎(chǔ)，而Eos是其關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞。Eos被激活后，能釋放EOS陽離子蛋白(ECP)、主要堿基蛋白(MBP)、血小板活化因子(PAF)和白三烯(LTｓ)等，還能促使肥大細(xì)胞釋放組胺、5羥色胺、LT及趨化因子，并建立“自身維持環(huán)”(serfsustainingcycte)吸引更多EOS聚集到炎癥反應(yīng)部位—氣道，從而形成一種周而復(fù)始的持續(xù)性(慢性)炎癥反應(yīng)，再釋放ECP、M

3、BP、PAF和緩激肽，這些細(xì)胞因子分布到氣道，對氣道黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性破壞作用，上皮成簇地脫落，將上皮細(xì)胞下的感覺神經(jīng)末梢C纖維暴露，從而形成氣道反應(yīng)性增高。近年來著眼于嗜酸粒細(xì)胞在哮喘氣道中的浸潤和凋亡的研究較多，但關(guān)于哮喘骨髓嗜酸粒細(xì)胞分化的研究較少。Eos來源于骨髓CD34祖細(xì)胞。一般情況下，Eos祖細(xì)胞(EosB祖細(xì)胞)在骨髓分化成熟為Eos，后者在骨髓中存儲數(shù)日后被釋放至血循環(huán)，并在1h內(nèi)進入組織[1]。哮喘患者體內(nèi)誘導(dǎo)CD

4、34細(xì)胞分化為Eos的刺激物增多，結(jié)果導(dǎo)致Eos從骨髓中釋放增多，隨后其在粘附分子等因子的作用下移出循環(huán)系統(tǒng)，并在其特異性的趨化物如Eotaxin等作用下向肺組織局部浸潤。IL3、IL5、IFNγ等均可影響骨髓嗜酸粒細(xì)胞的分化、增殖及遷移。研究表明，變應(yīng)原吸入后5小時IL3應(yīng)答的嗜酸粒細(xì)胞祖細(xì)胞顯著增加，變應(yīng)原吸入后12～24小時IL5應(yīng)答的嗜酸粒細(xì)胞祖細(xì)胞顯著增加，變應(yīng)原吸入后48小時，骨髓IFNγ水平也顯著增加，說明變應(yīng)原吸入后骨髓

5、多種細(xì)胞因子水平以時間依賴的變化方式調(diào)節(jié)和控制著骨髓嗜酸粒細(xì)胞祖細(xì)胞的分化、增殖及遷移活動[2]。其中IL5是關(guān)鍵的嗜酸粒細(xì)胞生成因子。IL5能特異作用于嗜酸粒細(xì)胞，不僅可遠(yuǎn)距離地作用于骨髓嗜酸粒細(xì)胞祖細(xì)胞促進其繁殖、分化，維持并延長成熟嗜酸粒細(xì)胞的生存期，引起嗜酸粒細(xì)胞趨化和黏附[3]。GMCSF是刺激骨髓嗜酸粒細(xì)胞分化、增殖和抗嗜酸粒細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子[4]。此外，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子Eotaxin也可在不依賴IL3、IL5、GMC

6、SF的情況下誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞從臍帶血CD34祖細(xì)胞的分化[5]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子5（STAT5）也具有明顯的促CD34嗜酸粒細(xì)胞分化、增殖作用[6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)哮喘動物骨髓CD34祖細(xì)胞表明IL5Rα及Eotaxin受體CCR3表達(dá)升高?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：糖皮質(zhì)激素潑尼松、強的松可抑制哮喘小鼠骨髓內(nèi)CD34造血細(xì)胞的增殖分化及遷移至外周血。但哮喘治療需堅持長期應(yīng)用激素，對人體副作用大。目前，西醫(yī)尚無另外成藥抑制哮喘骨髓Eos分化。

7、因此，尋找一種代替激素能夠降低哮喘骨髓Eos生成并且毒副作用少的藥物，具有巨大的市場潛力。而祖國醫(yī)學(xué)治療哮喘有上千年的歷史，積累了豐富的臨床經(jīng)驗，其中溫補腎陽法是治療緩解期哮喘的經(jīng)典治法之一，療效確切，毒副作用少?，F(xiàn)代醫(yī)家對腎陽虛在哮喘發(fā)病中的作用也有深刻認(rèn)識?？滦聵騕7]認(rèn)為無論何時期，腎虛(尤其是腎陽虛)是本病最根本的病理機制，并提出防治哮喘發(fā)作當(dāng)以補腎溫陽納氣為要。沈自尹[8]在用以溫補腎陽藥為主的溫陽片治療哮喘的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)腎虛

8、為哮喘患者的基本體質(zhì)。倪偉等[9]通過對緩解期哮喘患者腎陽虛與氣道炎癥的研究表明腎陽虛是哮喘緩解期的主要病機。實驗研究也表明，溫補腎陽法能對抗哮喘氣道炎癥，改善氣道痙攣，調(diào)節(jié)有下丘腦垂體腎上腺（HPA）軸等作用。如：張煒等[10]研究發(fā)現(xiàn)喘可治(巴戟天、仙靈脾等)可降低患者Eos絕對計數(shù)、IgE水平，消除氣道炎癥。張惠勇等[11]通過實驗發(fā)現(xiàn)喘可治(巴戟天、仙靈脾等)霧化吸人能通過影響IFNγ和IL4的含量來調(diào)節(jié)Th1／Th2細(xì)胞比例，

9、糾正免疫失衡，抑制氣道炎癥。許建華等[12]研究發(fā)現(xiàn)補腎陽(鹿角片、肉蓯蓉、巴戟天、鵝管石、熟附片、肉桂)可使哮喘大鼠β2受體mRNA明顯上升。還發(fā)現(xiàn)[13]補腎定喘湯（鹿角片、肉蓯蓉、巴戟天、鵝管石、熟地、山藥、山萸肉、茯苓、丹皮、澤瀉、熟附片、肉桂)能使肺組織過高的GR水平下降，可升高血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇（CT)水平，興奮垂體一腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)。溫補腎陽法能使哮喘患者外周血或肺泡灌洗液中Eos數(shù)目降低，但其降低Eo

10、s的機制尚未見有深入研究報道。Eos的產(chǎn)生，受骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞、調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)。中醫(yī)理論認(rèn)為腎主骨生髓，故應(yīng)用相關(guān)中藥調(diào)控骨髓造血微環(huán)境，可能有減少哮喘時Eos生成的作用。本研究選用臨床應(yīng)用頗為有效的溫補腎陽方（由生熟地各15g，菟絲子15g，補骨脂15g，仙靈脾20g，巴戟天15g等組成，以下簡稱補腎方）進行研究，探討溫補腎陽法對哮喘小鼠骨髓中Eos祖細(xì)胞向Eos分化及其調(diào)節(jié)因子的干預(yù)作用機制，具有較大理論意義，有助于臨床

11、選方用藥。1.GiembyczMALindsayMA.Pharmacologyoftheeosinophil.PharmacolRev199951:213340.2.DmanSCSehmiRGauvreauGMeta1.Kiicsofbonemarroweosinophilopoiesisassociatedcytokinesafterallergeninhalation.AmJRespirCritCareMed2004169(5):5

12、49550.3.江榮林沈華浩.IL5、Eotaxin與支氣管哮喘.國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊200424(1):l820.4.ShenZJEsnaultSMalterJS.ThepeptidylprolylisomerasePin1regulatesthestabilityofgranulocytemicrophagecolonystimulatingfactmRNAinactivatedeosinophils.Natlmmunol，2005

13、6(12):l280l287.5.BouchaibLSoussiGAQutaybaHetal.TheCCR3ReceptIsInvolvedinEosinophilDifferentiationIsUpRegulatedbyTh2CytokinesinCD34progenitCells.TheJournalofImmunology2002169:537–547.6.BuitenhuisM.BaltusB.Singaltransducer

14、activatoftranion5a(STATSa)isrequiredfeosinophildifferentionofhumancdblood—derivedCD34cells.Blood2003101(1):134l42.7.柯新橋補腎防喘述要湖北中醫(yī)雜志，1997，19(6)：38.沈自尹中西醫(yī)結(jié)合防治支氣管哮喘的探討中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1995，15(7)：4269.倪偉，于素霞，王宏長，等緩解期哮喘患者腎陽虛與氣道炎癥關(guān)系的

15、研究：附175例病例分析中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，20017(6)：6010.張煒，畢小利溫補腎陽法治療成人支氣管哮喘急性期20例遼寧中醫(yī)雜志2002，29(12)：72011.張惠勇，倪偉，張金福，等喘可治注射液霧化吸入對調(diào)節(jié)支氣管哮喘大鼠免疫失衡的實驗研究上海醫(yī)學(xué)200326(12)：90412.許建華，吳敦序，方肇勤，等不同補腎法對哮喘大鼠肺組織p2腎上腺素能受體mRNA的影響上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2001，15(3)：3813.許建華

16、，范忠澤，吳敦序，等補腎定喘湯對哮喘大鼠肺組織糖皮質(zhì)激素受體及血漿皮質(zhì)酮、ACTH的影響中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003，9(1)：27技術(shù)路線技術(shù)路線擬解決的關(guān)鍵問題擬解決的關(guān)鍵問題1.哮喘小鼠模型的復(fù)制。2.流式細(xì)胞儀檢測骨髓CD34造血祖細(xì)胞及CD34CCR3細(xì)胞比例。3.原位雜交結(jié)合免疫組化方法測定骨髓細(xì)胞IL5RαmRNA及CD34的表達(dá)。BALBc小鼠60只空白對照組模型組補腎方高劑量組陽性對照組(地塞米松)NS致敏NS霧化O

17、VAAl(OH)3百日咳滅活桿菌致敏2%OVA霧化激發(fā)7天補腎方低劑量組補腎方中劑量組NS灌胃7天末次激發(fā)后甲醛固定HE染色肺組織Eos浸潤情況抗凝血Eos計數(shù)原位雜交免疫組化離心、瑞氏姬姆薩染色；ELISA骨髓懸液Eos計數(shù)IL5、EotaxinCD34造血祖細(xì)胞CD34CCR3比例IL5RαmRNACD34表達(dá)流式細(xì)胞儀NS灌胃7天NS霧化7天NS灌胃7天OVA霧化7天灌胃7天OVA霧化7天灌胃7天OVA霧化7天灌胃7天OVA霧化7