干細(xì)胞培養(yǎng)全攻略

1、ES細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)A.FBSA.FBS的滅活與分裝的滅活與分裝1.1.化凍化凍將血清（FetalBovineSerum，Hyclone）從－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化凍過(guò)夜；也可室溫（或浸于自來(lái)水中）化凍，化凍后若不馬上滅活，可以放入4℃冰箱暫時(shí)保存；2.2.滅活滅活（1）放入室溫的水浴鍋內(nèi)開(kāi)始加熱（同時(shí)放入一個(gè)內(nèi)裝200ml自來(lái)水的血清瓶，插入一根溫度計(jì)，溫度監(jiān)控以此為準(zhǔn)）；（2）當(dāng)溫度計(jì)顯示56℃時(shí)，控制在此溫度30分鐘3分鐘

2、；若不小心使溫度上升超過(guò)56℃，則：若仍未超過(guò)60℃，且時(shí)間很短（比如：不超過(guò)5分鐘），則仍可使用；若超過(guò)60℃，或者時(shí)間較長(zhǎng)，則棄去不用，或者嘗試用于ME細(xì)胞的培養(yǎng)；（2）取出，自然冷卻至室溫（約需1－3小時(shí)），可分裝或－20℃繼續(xù)凍存；3.3.分裝分裝（1）轉(zhuǎn)入細(xì)胞間，用移液器將血清分裝，注意預(yù)先要將血清輕輕搖動(dòng)數(shù)周、混勻；吹出血清時(shí)要注意：不要吹出氣泡（血清很粘稠，很容易產(chǎn)生氣泡；如果已產(chǎn)生氣泡，則在酒精燈火焰上過(guò)一下）；標(biāo)好批號(hào)

3、和日期；（2）放入－20℃冰箱凍存(分裝一次大約可以使用1—2個(gè)月)。B.配制配制DMEMDMEM血清培養(yǎng)基血清培養(yǎng)基1.提前一天將分裝好的FBS從—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化凍；2.在細(xì)胞間中將FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸鈉、抗生素等），按照比例加入DMEM培養(yǎng)基中，作好標(biāo)簽；放入4℃冰箱保存。配制比例如下：50ml體積的干細(xì)胞培養(yǎng)液配制DMEM（Highglucose）DMEM培養(yǎng)基（高糖谷氨酰胺（）50ul非必需氨

4、基酸500ul丙酮酸鈉500ulB巰基乙醇？？雙抗50ul血清7.5mlLIF5ulESES細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM15%FBS2巰基乙醇：5.5uM1000XGibco21985023L谷氨酰胺：2mM100XSigmaG8540LIF：1000UmL10000XChemiconESGRO(LIF)10E7units，貨號(hào):ESG1107非必需氨基酸：100uM100XGibco11140050雙抗：100XGibco150700

5、63ESES細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞的復(fù)蘇1.提前制備好相應(yīng)數(shù)量的Feeder；2.準(zhǔn)備37－39℃的熱水，從液氮罐中取出所需凍存管（凍存細(xì)胞），迅速投入熱水中，迅速劇烈搖動(dòng)直至凍存液全部融化；3.轉(zhuǎn)入無(wú)菌間，1000轉(zhuǎn)分鐘離心510分鐘；4.棄上清，加入1mlES培養(yǎng)液輕輕吹打重懸，轉(zhuǎn)入鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中（凍存前細(xì)胞來(lái)自多大的培養(yǎng)皿，復(fù)蘇時(shí)就用相應(yīng)大小的培養(yǎng)皿），補(bǔ)加適量培養(yǎng)液；5.轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液；此后每24小時(shí)換一次液，每48

6、小時(shí)傳一次代（視生長(zhǎng)情況）。ESES細(xì)胞的換液細(xì)胞的換液1.提前半小時(shí)左右將培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，放于室溫（或者放于37℃溫箱內(nèi)）；2.細(xì)胞培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，相差顯微鏡下作常規(guī)觀察（判斷生長(zhǎng)情況，并確證未發(fā)生污染）后轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)；3.將ES細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的液體吸出、棄去，換新鮮培養(yǎng)基（6cm培養(yǎng)皿約5mL，3.5cm培養(yǎng)皿約3mL培養(yǎng)基；若死細(xì)胞較多則可以先用PBS洗一次，再加培養(yǎng)基）；4.放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。ESES細(xì)胞的傳代細(xì)

7、胞的傳代1.前一天下午做好所需數(shù)量的Feeder細(xì)胞板；2.提前半小時(shí)左右將培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，放于室溫（或者放于37℃溫箱內(nèi)）；3.將ES細(xì)胞培養(yǎng)皿、Feeder細(xì)胞培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出（相差顯微鏡下作常規(guī)觀察，F(xiàn)eeder細(xì)胞應(yīng)生長(zhǎng)良好，細(xì)胞覆蓋95%左右，至少90%以上的培養(yǎng)皿面積）；ES細(xì)胞應(yīng)生長(zhǎng)良好，接近長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，細(xì)胞集落大小一致、疏密均勻，集落形狀規(guī)則、呈橢圓形、邊緣光滑、表面光滑，細(xì)胞生長(zhǎng)致密、核大、胞質(zhì)少；4.將ES

8、細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的液體吸出、棄去，用PBS1mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用約30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，棄去；再作用1—5分鐘，不時(shí)觀察，待細(xì)胞層（皿底一層白色臟東西樣膜）出現(xiàn)裂縫并明顯開(kāi)始下滑時(shí)，補(bǔ)加培養(yǎng)基，適度吹打（視消化程度及管口粗細(xì)而定，至看不到明顯的大的細(xì)胞團(tuán)塊為止）；平均分到Feeder培養(yǎng)皿中（滴加，以免將Feeder細(xì)胞吹脫落下來(lái)），滴加補(bǔ)加培養(yǎng)基至5ml左右（滴加，以免將Feeder細(xì)胞吹脫落下來(lái)；若為3.5cm