h_d交換質(zhì)譜分析法在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的應(yīng)用

1、最初在 1954 年 Havidt[10] 等人發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)主鏈氨基上的氫原子能夠和溶液中的 D 交換，。Mandell[15]等人將 MALDI-TOF MS 和 H/D 交換聯(lián)合起來(lái)并將其作為研究蛋白質(zhì)之間H/D 交換質(zhì)譜分析法在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的應(yīng)用#袁航，劉艷，陳培燕，林東海，趙玉芬**5101520（廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361005）摘要：氫氘交換和質(zhì)譜相結(jié)合的分析方法廣泛

2、應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其動(dòng)力學(xué)研究，其具有樣品用量少、快速、靈敏、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。本論文著重從氫氘交換的原理及相關(guān)機(jī)制；影響氫氘交換的各個(gè)因素；氫氘交換質(zhì)譜法中常用質(zhì)譜檢測(cè)儀器，以及質(zhì)譜檢測(cè)分析法等四個(gè)方面進(jìn)行概述。關(guān)鍵詞：生物有機(jī)質(zhì)譜；氫氘交換；結(jié)構(gòu)生物學(xué)；綜述H/D exchange and mass spectrometry in Structural BiologyYuan Hang, Liu Yan, Chen Peiyan, Li

3、n Donghai, Zhao Yufen(Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, Department of Chemical Biology,Department of Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University,FuJian XiaMen 361005)

4、Abstract: The combination of H/D exchange (HDX) and mass spectrometry technology is widely applied to the kinetic and conformational studies of proteins. The HDX-MS method has some advantages, such as fewer samples, fast

5、 detection and more sensitive than the traditional methods. In this review, we discussed four main contents in details, containing the principle and the mechanism of the exchange, the effects on the HDX, the application

6、of the equipments, and the specific HDX-MS methods. Keywords: bioorganic mass spectrometry; H/D exchange; structural biology; review250 引言目前，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究方法主要包括 X-Ray[1]，NMR[2]和 MS[3]等技術(shù)。X-Ray 能夠獲得詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，然而衍射效果好的蛋白質(zhì)晶體不容易得到，耗

7、時(shí)長(zhǎng)，往往事倍功半，因此這種方法具有很大的局限性[4-7]。NMR 和 MS 是研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)最常用的兩種工具，但303540是 NMR 對(duì)濃度的要求要高于質(zhì)譜 2 個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)核磁的檢測(cè)受到蛋白質(zhì)大小的限制，在≦30KDa 的條件下才能夠準(zhǔn)確測(cè)定。此外，NMR 的靈敏度、蛋白質(zhì)的溶解度、分析時(shí)間的長(zhǎng)短、獨(dú)立氨基質(zhì)子的分配等也是 NMR 技術(shù)的障礙[8]。MS 可以在 fmol 水平上準(zhǔn)確分析分子量高達(dá)幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)的生物大分子，具有樣

8、品消耗量少、分辨率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，并且能夠和其他的技術(shù)如液相色譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行復(fù)雜樣品的分離分析[9]?！硰亩ㄟ^(guò)對(duì)蛋白質(zhì)主鏈的氫氘交換來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度。1993 年，Zhang[11]等人將氫氘交換和 MS 聯(lián)用能夠在不改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的情況來(lái)探測(cè)蛋白質(zhì)的溶解度。NMR 和 H/D交換聯(lián)用可以測(cè)得蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)的氫氘交換率，但是有些氨基上的氫原子交換速率太快，對(duì)于絕大部分的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間

9、的相互作用的研究，采用 NMR 技術(shù)還是無(wú)法做到的[12-14]基金項(xiàng)目：教育部新教師基金（200803841009） 作者簡(jiǎn)介：袁航，（1987-），女，研究生，主要研究方向：生物有機(jī)質(zhì)譜。 通信聯(lián)系人：劉艷，(1976-)，女，副教授，主要研究方向:生物有機(jī)質(zhì)譜. E-mail: stacyliu@xmu.edu.cn-1-圖.2 HDX 交換機(jī)制示意圖。A 為 EX1 機(jī)制，B 為 EX2 機(jī)制。Fig. 2 The H/ D e

10、xchange mechanism. A: EX1; B: EX275 EX1 機(jī)制（圖.2 A）中，氫氘交換速率 K2 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于重新折疊的速率；而 EX2 機(jī)制（圖.2B）中，重新折疊和內(nèi)在的氫氘交換反應(yīng)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，只有在發(fā)生了一部分重新折疊反應(yīng)后，氫氘交換才能進(jìn)行完全。EX 機(jī)制用公式表示如下式 1 所示[27]：X HclosedKopX HopenKchExchangeKcl808590其中，Kop 和 Kcl 分別是特定交換位點(diǎn)

11、的開(kāi)關(guān)速率常數(shù)，Kch 為化學(xué)交換速率常數(shù)，可以表征完全未被保護(hù)的氫的交換動(dòng)力學(xué)，對(duì)于氨基上的氫，某位點(diǎn)上 Kch 值取決于其相鄰的氨基酸側(cè)鏈和 pD 值 (pD=pH+0.4)[28]。在 pH≥4 時(shí)，化學(xué)交換速率受堿催化的影響，因此 Kex隨著 pH 的增加而增大，因此可以依據(jù) Kex 隨 pH 的變化來(lái)判斷 EX1 和 EX2[23]。從二肽模型化合物中獲得的參考數(shù)據(jù)對(duì)于任意溶劑條件下的 Kch 值的評(píng)估很有參考價(jià)值[29-31

12、]。在 EX2 機(jī)制中，Kcl>>Kch，整體的交換速率常數(shù)為 Kex 。Kex = Kop·Kch，則 Kop=Kop/Kcl是特定位點(diǎn)打開(kāi)反應(yīng)的速率常數(shù)，在 EX2 條件下，在交換反應(yīng)未發(fā)生之前許多的位點(diǎn)處于打開(kāi)的構(gòu)象狀態(tài)。相反的，在 EX1 條件下，Kch>>Kcl，在蛋白質(zhì)的開(kāi)放區(qū)域?qū)?huì)發(fā)生完全的氘標(biāo)記，此時(shí) Kex=Kop〔[32]在自然狀態(tài)下，氨基 HDX 會(huì)遵循 EX2 機(jī)制，但是在蛋白質(zhì)