系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞CD70(TNFSF7)基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾和甲基化CpG結(jié)合蛋白水平的研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種慢性自身免疫性疾病，其免疫系統(tǒng)活躍，產(chǎn)生大量自身抗體并對(duì)多系統(tǒng)多器官造成損害。共刺激分子如CD70-CD27和CD154-CD40對(duì)于B細(xì)胞的活化起著重要作用。SEL患者CD4+T淋巴細(xì)胞過度表達(dá)CD70、CD11a、Perforin、CD40 ligand，這些基因的調(diào)控序列的CpGs存在異常低甲基化。由于DNA是與組蛋白一起共同有序地存在于細(xì)胞核中，因此DNA甲基化與組蛋白修飾可能存在相互影響。目前關(guān)于

2、SLE組蛋白修飾的研究甚少。我們的前期研究結(jié)果顯示，SLE患者存在基因組CD4+T細(xì)胞存在H3和H4低乙?；约癏3K9低甲基化。然而，特定基因的組蛋白修飾與基因組總體組蛋白修飾可能不一致。因此，我們對(duì)編碼CD70的TNFSF7這一特定基因調(diào)控序列組蛋白修飾進(jìn)行研究。用5-azaC(一種DNMTs抑制劑)處理的正常CD4+T細(xì)胞和SLE患者CD4+T細(xì)胞都過度表達(dá)CD70，其TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域都存在低甲基化。所以，本課題將研究SLE

3、患者CD4+T細(xì)胞CD70mRNA表達(dá)、TNFSF7基因調(diào)控序列組蛋白修飾、甲基化CpG結(jié)合蛋白水平及其相互關(guān)系，以及對(duì)正常CD4+T細(xì)胞進(jìn)行表觀遺傳十預(yù)后對(duì)該基因表達(dá)以及組蛋白修飾、甲基化CpG結(jié)合蛋白水平的影響。 第一部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞CD70(TNFSF7)啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾和甲基化CpG結(jié)合蛋白異常的研究 目的：表觀遺傳學(xué)兩大主要修飾方式--DNA甲基化和組蛋白修飾，在基因調(diào)控中起重要作用。系

4、統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)T細(xì)胞過度表達(dá)共刺激分子CD70可激活B細(xì)胞過度活化和產(chǎn)生大量自身抗體。SLE患者CD4+T細(xì)胞CD70基因調(diào)控序列存在低甲基化，但其甲基化CpG結(jié)合蛋白以及組蛋白修飾的情況未見報(bào)道。本研究主要探討SLE患者CD4+T細(xì)胞CD70編碼基因TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域核心組蛋白H3、H4的乙?；虷3K4、H3K27的甲基化狀態(tài)以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MBD2、MeCP2的結(jié)合水平。 方法：22例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者

5、均來自我院門診和住院病人，活動(dòng)性患者11例，其中男2例，女8例，年齡17～39歲，平均年齡28.73±6.45歲，平均SLEDAI評(píng)分11.09±3.65分，非活動(dòng)性患者11例，其中男2例，女8例，年齡19～53歲，平均年齡34.27±9.96歲，平均SLEDAI評(píng)分2.18±1.89分。正常對(duì)照組9例，男3例，女6例，年齡23～40歲，平均28.5±5.2歲，均為本院健康醫(yī)務(wù)人員。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分離外

6、周血CD4+T細(xì)胞，染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)方法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)法柃測TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域H3、H4乙?；约癏3K4二甲基化、H3K27三甲基化水平以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MBD2、MeCP2的結(jié)合水平。 結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，活動(dòng)性SLE患者CD4+T細(xì)胞CD70mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)，且與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)呈正相關(guān)(R=0.561，P<0.05)；啟動(dòng)子區(qū)

7、域組蛋白H3呈高乙?；癄顟B(tài)(P=0.008)，且H3乙?；脚c疾病活動(dòng)程度呈正相關(guān)(R=0.765，P<0.01)；H3K4二甲基化水平顯著增高(P=0.011)，也與疾病活動(dòng)程度呈正相關(guān)(R=0.66，P<0.05)；三甲基化H3K27下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066)。此外，我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，活動(dòng)性SLE患者CD4+T細(xì)胞該啟動(dòng)子區(qū)域MeCP2結(jié)合量明顯降低(P=0.038)。 結(jié)論：TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修

8、飾如核心組蛋白H3高乙?；?、H3K4高甲基化以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MeCP2減少可能在SLECD4+T細(xì)胞CD70過表達(dá)中起重要作用。 第二部分表觀遺傳干預(yù)對(duì)正常CD4+T細(xì)胞CD70(TNFSF7)基因表達(dá)以及組蛋白修飾影響的研究 目的：探討DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷(5-azaC)、組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌素(TSA)單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)對(duì)正常CD4+T細(xì)胞CD70表達(dá)的影響，以及對(duì)TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域組

9、蛋白核心組蛋白H3/H4的乙酰化和H3K4、H3K27的甲基化狀態(tài)以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MBD2、MeCP2的結(jié)合水平的影響。 方法：采用密度梯度離心法分離正常外周血單個(gè)核細(xì)胞，用PHA刺激培養(yǎng)16-24小時(shí)后，加免疫磁珠分離CD4+T細(xì)胞，分別給予5-azaC、TSA單獨(dú)處理培養(yǎng)或聯(lián)合培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后收集細(xì)胞，用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)方法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)法檢測TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域H3/H

10、4乙?；约癏3K4二甲基化、H3K27三甲基化水平以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MBD2、MeCP2的結(jié)合水平。 結(jié)果：5-azaC和TSA單獨(dú)或聯(lián)合處理都能顯著增加CD4+T細(xì)胞CD70mRNA的表達(dá)(P<0.05)。5-azaC單獨(dú)處理能顯著增加TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域H3K4二甲基化水平(P=0.016)，降低MeCP2的結(jié)合水平(P=0.035)；TSA單獨(dú)處理能顯著增加組蛋白H3、H4乙酰化以及H3K4二甲基化水平(P<0.