生物工程外文翻譯--flash 和 reash的蛋白標(biāo)記（譯文）

1、中文 中文 8800 字出處： 出處：Machleidt T, Robers M, Hanson G T. Protein labeling with FlAsH and ReAsH[J]. Methods in Molecular Biology, 2007, 356:209-220.FlAsH 和 ReAsH 的蛋白標(biāo)記 的蛋白標(biāo)記Thomas Thomas Machleidt, Machleidt, Matt Matt Rober

2、s, Robers, and and George George T. T. Hanson Hanson摘要 摘要人健康或疾病，活細(xì)胞中的生化表象和表型變化，已成為調(diào)查和了解管理所有細(xì)胞生理功能分子機制的關(guān)鍵。報道者指出，已證明來自熒光蛋白（FPS）的基因編碼，在活細(xì)胞中的定位和相互作用的研究是非常有用的。然而，大尺寸和 FP 的光譜屬性對他的使用產(chǎn)生了一定的局限性。最近開發(fā)的熒光含砷 U 形（FLASH / 四半胱氨酸序列）粘結(jié)劑技術(shù)

3、成為一個用于 FP 蛋白標(biāo)記和細(xì)胞定位研究有前途的替代品。具有一個小分子檢測試劑盒的一個小的基因編碼的肽標(biāo)記組合，使得這項技術(shù)特別適合很難與作為分子標(biāo)記的熒光蛋白相聯(lián)系的活細(xì)胞的生化變化的調(diào)查。我們描述了這項技術(shù)的實際應(yīng)用于活細(xì)胞圖像的蛋白質(zhì)動力學(xué)。關(guān)鍵詞：雙砷化合物 ，閃光;熒光;熒光蛋白;網(wǎng)關(guān);高內(nèi)涵篩選活細(xì)胞成像;Lumio;蛋白激酶C，蛋白標(biāo)記; ReAsH;試鹵靈;標(biāo)簽; 四半胱氨酸序列。1、介紹 介紹目前的高含量分析最主要的

4、表現(xiàn)是，使用免疫熒光作為主要的標(biāo)簽/檢測方法為終點分析。雖然，由于它的靈活性和易用性使這方法很有價值，但是作為終點分析是有限的。在活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的動態(tài)實時分析的能力是為深入了解與細(xì)胞行為與功能相關(guān)的復(fù)雜的生化和表型變化（1） 。傳統(tǒng)上，在活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的分析和檢測。主要是依靠作為基因編碼標(biāo)簽的熒光蛋白的使用（2） （FPS） 。盡管其擁有對蛋白質(zhì)動力學(xué)分析的通用性和實用性，使用的 FPS 有一定的局限性。因為它們的 FP 大?。?8

5、KD）有潛在的干擾融合部分的活動，定位，或結(jié)構(gòu)并且能夠，通常僅可以融合 N 或 C 為終點的蛋白質(zhì)（3） 。此外，F(xiàn)Ps 只提供有限的有一股相對缺乏有用的紅色 FP 版本的頻譜品種，即使最近有報道增強紅色 FP變種的發(fā)展（4） 。近年來，為解決 FPS 的一些問題，一些替代活體細(xì)胞標(biāo)記方法已被引入（如頻譜的限制） （5,6） 。然而，所有已公布的方法，都依靠相當(dāng)可觀的多肽的融合蛋白，因此，與 FP的共享，具有靶蛋白功能的立體標(biāo)記存在潛在

6、干擾的缺點。最近在加州大學(xué)圣迭戈分校的 Roger Tsien 小組，開發(fā)出一種在活細(xì)胞特別標(biāo)記蛋白方法，使用親和力很高的小肽標(biāo)記和一個小分子的標(biāo)簽（7） 。這項技術(shù)利用高親和力的四半胱氨酸序列（TC） ，由兩個氨基酸間隔區(qū)分離的兩個半胱氨酸組成，在還原條件下形成有機砷化合物（圖 1） 。成功地利用了這一原則產(chǎn)生熒光砷發(fā)夾粘結(jié)劑（FLASH） ，包含 4'和5'位置四半胱氨酸替換膜的滲透染料熒光衍生。兩個半胱氨酸對結(jié)合具

7、有高親和力（已在ref.8 有記錄，通過四個可逆的共價鍵的形成一個有效的離解常數(shù) 10-11 中號的 Flash 組（圖 1） 。融合了 TC 標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因，在 biarsenic 標(biāo)記熒光染料培養(yǎng)，活細(xì)胞中允許特定的標(biāo)記的融合蛋白 7） 。最早的的 TC 標(biāo)記被設(shè)計成為短公認(rèn)的 α-螺旋的圖案，依從的是一個 α-螺旋結(jié)構(gòu)提供了一個最佳的結(jié)合環(huán)境的假設(shè)（7） 。然而，進一步系統(tǒng)調(diào)查不同的間隔區(qū)的 TC 圖案，破解插入螺旋甘氨

8、酸和脯氨酸，導(dǎo)致大大增強 FLASH 對 TC 圖案的親和力（8） 。這項技術(shù)的另一個方面是，顯示了一點熒光的未綁定的，直到它綁定到 TC的圖案，結(jié)果會導(dǎo)致熒光約束力的大量增加（7） 。Tsien 實驗室通過 biarsenical 染料發(fā)展，擴大兩個 TC 標(biāo)記的顏色范圍，試鹵靈派生的紅色熒光染料 ReAsH 和藍色熒光biarsenical 的 CHoXAsH，3,6 - 二羥基酮衍生物（8） 。這項技術(shù)也被應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象白。

9、特別注意的是給出的標(biāo)記過程。我們展示了大量例子強調(diào)這個活細(xì)胞標(biāo)記方法的多功能性，如糖皮質(zhì)激素受體，β-微管蛋白和蛋白激酶 C-α（PKC-α）的標(biāo)簽的數(shù)量，證明在活細(xì)胞中 TC 標(biāo)記蛋白質(zhì)成功檢測（圖 2A-C 的） 。3.1、TC 標(biāo)記的融合蛋白的產(chǎn)生和表達 標(biāo)記的融合蛋白的產(chǎn)生和表達蛋白質(zhì)的 Flash 檢測需要生成一個表達式構(gòu)建含有該基因的興趣和融合或集成的 TC標(biāo)簽。為 TC 標(biāo)簽的基本核心序列 CCXXCC 的。為 XX 間隔

10、使用的最常見的氨基酸是脯氨酸和甘氨酸（Invitrogen 的表達載體中也使用） ，但使用不同的墊片已報道（8） 。TC 的標(biāo)簽可以很容易地添加到任何的 N-或 C-末端的靶蛋白。此外，小規(guī)模的 TC標(biāo)簽往往允許其插入到目標(biāo)蛋白的特定領(lǐng)域，而不會干擾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能，為作為甘酸 A2A 腺苷受體（10）和哺乳動物細(xì)胞維甲酸結(jié)合蛋白（20 ，21,23） 。這些研究表明，短的 α-螺旋或循環(huán)的是最適合整合/替代的 TC 標(biāo)記的地點?？?/p>

11、體而言，TC 標(biāo)簽提供出色的靈活性給標(biāo)記放置，結(jié)合潛在存在的總體目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的最小干擾。小尺寸的TC 標(biāo)記也允許通過 PCR 和克隆何想要表達載體的 PCR 產(chǎn)物任，使用標(biāo)準(zhǔn) DNA 重組方法。蛋白質(zhì)和 TC 標(biāo)記之間的間隔序列通常不是必需的。一個額外的選項是 Invitrogen 公司的 Gateway®系統(tǒng)的使用，包括哺乳動物已經(jīng)含有 N-或 C-末端 TC 標(biāo)簽的表達載體。網(wǎng)關(guān)系統(tǒng)允許快速和方便的新一代 N-或

12、C-端 TC-融合蛋白使用基于λ噬菌體的位點特異性重組。Invitrogen 公司的網(wǎng)站上可以找到有關(guān)的的網(wǎng)關(guān)克隆系統(tǒng)和網(wǎng)關(guān)盧米奧載體。與任何其他的融合結(jié)構(gòu)，適當(dāng)?shù)谋磉_，定位，功能的融合蛋白一樣，在實驗室使用其結(jié)構(gòu)前需要對其游離蛋白進行驗證（見注 2） 。TC 融合蛋白的穩(wěn)定和瞬間表達，合適各種各樣的生物和細(xì)胞株（見表 1） 。我們很快采用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)譯方法(?脂質(zhì)體和脂質(zhì)體 2000）的表達了在各種不同的細(xì)胞系（HEK293，HeLa 細(xì)

13、胞，CHO 細(xì)胞，A549 細(xì)胞和 NIH3T3）一些不同的蛋白質(zhì)（結(jié)構(gòu)蛋白激酶，GPCRs 的，和核激素受體，等） ，沒有遇到關(guān)于蛋白表達或細(xì)胞活力任何問題， 。以下協(xié)議為下一代提供指導(dǎo)和怎樣使用 TC 標(biāo)記的融合蛋白。圖 2，使用 FLASH / ReAsH 染色的活細(xì)胞成像蛋白質(zhì)動力學(xué)的例子。 CHO 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（一）糖皮質(zhì)激素受體-TC（GR - TC） ， （二）蛋白激酶 C-α-TC 或（三）TC-微管蛋白α。之后細(xì)胞轉(zhuǎn)移

14、到腔蓋玻片上，細(xì)胞 2 微米 Flash 或 ReAsH 達 60 分鐘且保持在 37°C，和隨后用含有 200μM 的 EDT2 的 OPTI-MEM 清洗三次。 （一）與糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不及時治療或 20 分鐘或者 10μM 的地塞米松治療。地塞米松結(jié)合并激活的 GR GR-TC 的從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運。 （二）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與 PKC 留給未經(jīng)治療或治療 20 分鐘為 1μm。 PMA 處理導(dǎo)致激活蛋白激酶 C

15、-1，隨后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜。 （三）與 TC-β-微管蛋白的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，不及時治療或治療 60 分鐘與 10 毫米長春新堿誘導(dǎo)微管解聚和短期的微管蛋白聚合的外觀。兩個圖像顯示樣品內(nèi)的不同領(lǐng)域。圖像要求使用 Deltavision 圖像復(fù)原系統(tǒng)（奧林巴斯 IX-71 倒置顯微鏡配備載脂蛋白×60，不適用 1.4 目標(biāo)） 。所有圖像進行反皺處理。3.2、代 、代 TC 標(biāo)簽的蛋白激酶 標(biāo)簽的蛋白激酶 C-α表達構(gòu)建 α表達構(gòu)建我

16、們正在使用的蛋白激酶 C-α作為說明表達步驟一個例子，包括傳代，表達和編碼 TC 標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。在這個例子中，蛋白激酶 C-α的 DNA 被 PCR 直接克隆，從 HeLa 細(xì)胞表達的基因，通過使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)。3.2.1、克隆1、對于傳代的 C-端 TC 融合蛋白結(jié)構(gòu)我們修改了 Invitrogen 的哺乳動物表達載體?/ V5的 pcDNA6 有它的 TC 標(biāo)記來代替。2、全長的蛋白激酶 C-α片段被克隆成修改 HindII