分子生物學(xué)重要試題及答案

1、1、 試述利用基因工程的技術(shù)調(diào)控基因表達(dá)的主要方法 試述利用基因工程的技術(shù)調(diào)控基因表達(dá)的主要方法（1） 、基因表達(dá)系列分析技術(shù)基因表達(dá)系列分析技術(shù)是一種以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息。其基本原理是根據(jù)理論上任何長(zhǎng)度超過(guò) 9-10 個(gè)堿基的核苷酸片段可代表一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特意序列，因此，選擇特定的限制性內(nèi)切酶分離轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中這些代表基因特異性的 9-10 各堿基的核苷酸序列并制成標(biāo)

2、簽連接、克隆測(cè)序，根據(jù)其占總標(biāo)簽數(shù)的比例即可分析其對(duì)應(yīng)編碼基因的表達(dá)頻率。（2） 、RNA 選擇性剪切機(jī)制RNA 的選擇性剪切是指用不同的剪切方式(選擇不同的剪切位點(diǎn)組合)從一個(gè) mRNA 前體產(chǎn)生不同的 mRNA 剪切異構(gòu)體的過(guò)程。一般將選擇性剪切分為如下幾類：平衡剪切、5’選擇性剪切、3’選擇性剪切，外顯子遺漏，相互排斥性剪切。可以 RT-PCR 的方法研究一個(gè)基因是否存在選擇性剪切。其步驟是：首先以 cRNA 兩端特異性引物或來(lái)自

3、不同外顯子的引物序列在不同組織來(lái)源的 RNA 樣品中進(jìn)行擴(kuò)增，觀察 PCR 產(chǎn)物大小是否存在差異。如果發(fā)現(xiàn)差異，測(cè)序后可以分析出這種差異是否來(lái)自于選擇性剪切。選擇性剪切使一個(gè)基因翻譯為多種蛋白質(zhì)序列，是基因表達(dá)多樣性的重要表現(xiàn)形式。（3） 、原位雜交技術(shù)原位雜交(in situ hybridization,ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。通常

4、可以分為 RNA 原位雜交和染色體原位雜交兩大類：1、RNA 原位雜交用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的 mRNA 分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈 RNA，就可以通過(guò)檢測(cè)放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞水平上作出定性定量分析；2、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術(shù)首先對(duì)于寡核苷酸探針做特殊修飾

5、和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或 DNA 上特定的序列結(jié)合，再通過(guò)與熒光素分子相偶聯(lián)的單克隆抗體來(lái)確定該 DNA 序列在染色體的位置。FISH 技術(shù)不需要放射性同位素，實(shí)驗(yàn)周期短，檢測(cè)靈敏度高。（4）定點(diǎn)突變技術(shù)定點(diǎn)突變是重組 DNA 進(jìn)化的基礎(chǔ)，該方法通過(guò)改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來(lái)改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個(gè)氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造 DNA 調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、

6、引入新的酶切位點(diǎn)等。但目前為止選擇氨基酸突變的位點(diǎn)存在一定的盲目性。主要是采用兩種 PCR 方法來(lái)實(shí)現(xiàn)：重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。（5）RNAi 技術(shù)RNA 干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)利用雙鏈小 RNA 高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷體內(nèi)靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。其過(guò)程一般為：在Dicer 的參與下，細(xì)胞中的雙鏈 RNA 首先被降解形成 21-25 個(gè)核

7、苷酸的小片段雙鏈RNA(siRNA)，然后又 siRNA 中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)的核蛋白體，再又 RISC 介導(dǎo)切割目的 mRNA 分子中與 siRNA 反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾基因表達(dá)的功能。同時(shí)，siRNA 可作為特殊引物，在依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶的作用下，以目的 mRNA 為模板合成 dsRNA，后者又可被降解為新的 siRNA，重新進(jìn)入上述循環(huán)。(6)一些基本分子生物

8、學(xué)手段在啟動(dòng)子上游構(gòu)建增強(qiáng)子、細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)物生成等。2、論述原核生物和真核生物基因組的異同 、論述原核生物和真核生物基因組的異同1 原核生物的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 原核生物的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)原核生物的基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn) 原核生物的基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)1.轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控?zé)o論原核生物還是真核生物的基因調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄水平的,原核生物不同于真核生物的基因結(jié)構(gòu),存在轉(zhuǎn)錄單元,即操縱子，原核生物的轉(zhuǎn)錄受操縱子控制。1.1 RNA 聚合酶與啟動(dòng)子的影

9、響DNA 轉(zhuǎn)錄 RNA 合成起始時(shí),只有帶有σ因子的全酶才能專一地與 DNA 上的啟動(dòng)子結(jié)合，σ因子能提高酶辨認(rèn)啟動(dòng)子的能力，若啟動(dòng)子與聚合酶結(jié)合緊密,則基因獲得較高水平的轉(zhuǎn)錄,否則,轉(zhuǎn)錄水平較低，另外,還發(fā)現(xiàn)有些基因有增強(qiáng)子，位于轉(zhuǎn)錄起始的上游,是強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列。1.2 代謝產(chǎn)物的調(diào)控可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)：在代謝產(chǎn)物或化合物的誘導(dǎo)下,使基因活化,操縱子由關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)為工作狀態(tài)，如大腸桿菌的乳糖操縱子：無(wú)誘導(dǎo)物存在時(shí)，阻遏物與操作基因結(jié)合使得結(jié)

10、構(gòu)基因不能正常轉(zhuǎn)錄；誘導(dǎo)物（乳糖或 IPTG）存在，與阻遏物結(jié)合時(shí)，阻遏物從操縱基因上脫離下來(lái)，RNA 聚合酶便可通過(guò)啟動(dòng)子和操作基因正常轉(zhuǎn)錄出一條多順?lè)醋觤RNA 從而翻譯得到三種酶?？勺瓒粽{(diào)節(jié)：基因轉(zhuǎn)錄平時(shí)是開啟的,但由于某些特殊代謝產(chǎn)物或化合物的積累將其關(guān)閉,阻遏基因的轉(zhuǎn)錄,不能合成蛋白質(zhì)或酶。如大腸桿菌的色氨酸操縱子：trp 操縱子轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是通過(guò)阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)的。產(chǎn)生阻遏蛋白的基因是 trpR，它結(jié)合于 trp 操縱基因特異

11、序列,阻止轉(zhuǎn)錄起始。當(dāng) Trp 水平低時(shí),阻遏蛋白以一種非活性形式存在,不能結(jié)合 DNA。這時(shí) Trp 生物合成途徑被激活；trp 操縱子轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控是通過(guò)弱化作用實(shí)現(xiàn)的。在大腸桿菌 trp operon,前導(dǎo)區(qū)的堿基序列包括 4 個(gè)分別以 1、2、3 和 4 表示的片段,能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對(duì), 1 - 2 和 3 -4 配對(duì),或 2 - 3 配對(duì), 3 - 4 配對(duì)區(qū)正好位于終止密碼子的識(shí)別區(qū)。前導(dǎo)序列有

12、相鄰的兩個(gè)色氨酸密碼子,當(dāng)培養(yǎng)基中 Trp 濃度很低時(shí),負(fù)載有 Trp 的 tR2NATrp 也就少,這樣翻譯通過(guò)兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度就會(huì)很慢,當(dāng) 4 區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí),核糖體滯留 1 區(qū),這時(shí)的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是 2 - 3 配對(duì),不形成 3 - 4 配對(duì)的終止結(jié)構(gòu),所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行。反之,核糖體可順利通過(guò)兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子,在 4 區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前,核糖體就到達(dá) 2 區(qū),這樣使 2 - 3 不能配對(duì), 3 - 4 區(qū)可以配對(duì)形成終止

13、子結(jié)構(gòu), 轉(zhuǎn)錄停止。1.3 降解物對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)細(xì)菌在有葡萄糖存在的培養(yǎng)基情況下,即使加入乳糖、半乳糖等誘導(dǎo)物,與其相應(yīng)的操縱子也不會(huì)啟動(dòng)，這是由于葡萄糖抑制了細(xì)菌的腺苷酸環(huán)化酶,減少環(huán)腺苷酸(cAMP)的合成。當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖減少時(shí),則環(huán)腺苷酸的活力提高, cAMP 的合成增加, cAMP 與 CRP 形成復(fù)合物并與操縱子結(jié)合,促進(jìn)乳糖的表達(dá)。降解物的抑制作用是通過(guò)促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄來(lái)正常調(diào)節(jié)基因表達(dá)的。1.4 細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)對(duì)基因

14、表達(dá)的調(diào)控細(xì)菌在生存條件危急時(shí),如氨基酸全面匱乏,細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng):包括生產(chǎn)各種 RNA、糖、脂肪、蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程均被停止，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌細(xì)胞中存在大量不載氨基酸的 tRNA,空載的 tRNA 激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶,使鳥苷四磷酸(ppGpp)大量合成, ppGpp 的出現(xiàn)會(huì)關(guān)閉許多基因·除 ppGpp 外,實(shí)施應(yīng)急反應(yīng)的額信號(hào)還有鳥苷五磷酸(pppGpp)·它們的作用十分廣泛,影響一大批操縱子,