微生物發(fā)酵過(guò)程還原糖光度傳感器的研究.pdf

1、我國(guó)發(fā)酵工業(yè)是一個(gè)品種繁多，門類齊全，具有相當(dāng)規(guī)模的獨(dú)立工業(yè)體系。產(chǎn)品包括酒類、有機(jī)酸、抗生素、酶制劑、淀粉糖、氨基酸、核苷酸、維生素、有機(jī)溶劑、微生物殺蟲劑、植物激素、單細(xì)胞蛋白等。應(yīng)用領(lǐng)域涉及醫(yī)藥、衛(wèi)生、輕工、化工、農(nóng)業(yè)、能源、環(huán)保等諸多行業(yè)；其中，味精、檸檬酸、酶制劑、酵母產(chǎn)量居世界前列。發(fā)酵工業(yè)已成為國(guó)民經(jīng)濟(jì)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。 發(fā)酵過(guò)程的在線檢測(cè)和自動(dòng)控制是發(fā)酵工業(yè)技術(shù)進(jìn)步的重要發(fā)展方向。傳感器技術(shù)作為發(fā)酵過(guò)程信息的發(fā)

2、生源，對(duì)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程的在線檢測(cè)和自動(dòng)控制起到關(guān)鍵作用。然而，目前我國(guó)發(fā)酵生產(chǎn)上發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)化控制程度不高，落后于其他領(lǐng)域。用于發(fā)酵生產(chǎn)中的傳感器主要是進(jìn)行罐內(nèi)物化參數(shù)的測(cè)定。此類傳感器的性能較穩(wěn)定，應(yīng)用也較為普遍，實(shí)現(xiàn)了部分參數(shù)的在線監(jiān)控。但與發(fā)酵最優(yōu)化的自動(dòng)控制目標(biāo)相去甚遠(yuǎn)，即難以成功建立對(duì)培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)的反饋性控制。因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程是一個(gè)非性線、多變量和隨機(jī)性的動(dòng)態(tài)過(guò)程，發(fā)酵體系是一個(gè)復(fù)雜的被控對(duì)象。溫度、溶氧、pH、培養(yǎng)基成分、細(xì)胞

3、形態(tài)、細(xì)胞濃度、產(chǎn)物組成及含量等均是發(fā)酵過(guò)程的重要控制參數(shù)。隨著計(jì)算機(jī)及控制技術(shù)的突飛猛進(jìn)，生物傳感器技術(shù)的發(fā)展，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型研究的完善，發(fā)酵過(guò)程控制系統(tǒng)愈來(lái)愈多，應(yīng)用范圍亦越來(lái)越廣。但是，工業(yè)上實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程最優(yōu)化自動(dòng)控制的實(shí)例卻不多，仍以人工控制和半自動(dòng)控制為主。其發(fā)展滯后的重要原因之一就是基于細(xì)胞代謝的生化參數(shù)信息的缺乏。 葡萄糖(還原糖)作為微生物的主要碳源和能源，是發(fā)酵過(guò)程中重要的生化控制參數(shù)，它在培養(yǎng)基中的含量及在發(fā)

4、酵過(guò)程中的濃度變化直接影響發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量、收率和生產(chǎn)成本。目前實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中常采用傳統(tǒng)的手工滴定法或比色法進(jìn)行還原糖的測(cè)定，這些方法操作繁瑣、人為誤差大，給企業(yè)生產(chǎn)管理帶來(lái)很多麻煩，也嚴(yán)重阻礙了發(fā)酵過(guò)程在線檢測(cè)和自動(dòng)控制技術(shù)的應(yīng)用。解決還原糖測(cè)定的傳感器技術(shù)成為發(fā)酵工業(yè)迫切需要解決的技術(shù)難題之一。 生化傳感器是一種集電子科學(xué)、生物化學(xué)和材料科學(xué)于一體的新型的分析技術(shù)，它是將生化物質(zhì)(待測(cè)物質(zhì))通過(guò)敏感器件，定量和高選擇性地轉(zhuǎn)化為

5、可監(jiān)測(cè)的光電信號(hào)，并由電子儀器進(jìn)行信息分析、處理，得到相關(guān)環(huán)境的生化物質(zhì)的信息。它從上世紀(jì)80年代起，生化傳感器技術(shù)和市場(chǎng)有了較快的發(fā)展，在環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、發(fā)酵過(guò)程控制、石油化工等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但有關(guān)還原糖檢測(cè)的傳感器技術(shù)研究和應(yīng)用報(bào)道不多。 很多分析儀器可以進(jìn)行還原糖或葡萄糖的測(cè)定，但對(duì)于發(fā)酵樣品中還原糖測(cè)定，這些儀器分析方法操作繁瑣、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，測(cè)定成本高，不能適合發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程大批量、高頻率測(cè)定的實(shí)

6、際要求。本研究根據(jù)還原糖氧化還原滴定原理，將生化技術(shù)與光、電技術(shù)相結(jié)合，建立一種智能化、實(shí)用化的生化傳感分析系統(tǒng)，用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程還原糖的快速檢測(cè)。 采用光度傳感器作為信號(hào)檢測(cè)器件，響應(yīng)速度快，適用環(huán)境廣，且傳感器不直接與反應(yīng)溶液接觸，性能更加穩(wěn)定，比離子電極具有更大的優(yōu)勢(shì)。。但對(duì)于發(fā)酵樣品的特殊性，如菌體引起的液體濁度、發(fā)酵液的顏色等，光度傳感器與常規(guī)的吸光光譜分析方法一樣面臨光度測(cè)量的干擾問(wèn)題；而且，發(fā)酵過(guò)程菌體濁度

7、隨發(fā)酵時(shí)間的不同而變化；另外，還原糖化學(xué)分析過(guò)程常涉及高溫，斐林試劑滴定要在沸騰狀態(tài)下進(jìn)行。因此，解決樣品的干擾和溫度控制這兩方面的問(wèn)題是本研究的主要技術(shù)難點(diǎn)。 在最初的設(shè)計(jì)方案中曾采用流動(dòng)注射吸光光譜方法進(jìn)行還原糖的測(cè)定。這一測(cè)試系統(tǒng)可以對(duì)一些簡(jiǎn)單樣品進(jìn)行還原糖測(cè)定、如蜂蜜、葡萄糖試劑等。對(duì)發(fā)酵樣品仍需要離心、過(guò)濾、活性碳脫色后測(cè)定。因?yàn)?，樣品的濁度直接影響到光吸收面積或峰值的大小。還原糖容量分析法是根據(jù)滴定終點(diǎn)滴定液消耗

8、體積來(lái)計(jì)算被測(cè)樣品中還原糖含量。因此，只要通過(guò)光度測(cè)定準(zhǔn)確判斷終點(diǎn)就可以完成測(cè)定。本研究采用單色光電二極管作為光源，硅光電池作為光信號(hào)轉(zhuǎn)換器，進(jìn)行還原糖滴定反應(yīng)終點(diǎn)顏色變化的判斷。但在測(cè)定時(shí)，一次進(jìn)樣量過(guò)多，液體濁度和顏色增加，影響傳感器信號(hào)的產(chǎn)生。對(duì)26小時(shí)谷氨酸發(fā)酵液測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，進(jìn)樣量超過(guò)800 μ1，傳感器電壓信號(hào)最大值低于0.26 mv，滴定終點(diǎn)不能出現(xiàn)可檢測(cè)的突變電壓信號(hào)。本系統(tǒng)通過(guò)調(diào)整反應(yīng)池體積和試劑濃度，控制進(jìn)樣量在5

9、00μ1以內(nèi)，則發(fā)酵液濁度、顏色對(duì)測(cè)定結(jié)果不產(chǎn)生影響。 溫度控制要解決兩個(gè)問(wèn)題，一個(gè)是加熱速度，一個(gè)是加熱產(chǎn)生的氣泡干擾。傳統(tǒng)的液體加熱方式主要是采用電熱絲，如電爐或加熱棒。這種加熱方式簡(jiǎn)單、方便，但加熱速度慢，溫度滯后效應(yīng)大。Andre(1999)曾在流動(dòng)注射分析中采用微波爐加熱法測(cè)定葡萄酒中還原糖。該法能快速提升液體溫度，無(wú)溫度滯后，但不具備實(shí)用價(jià)值。歐姆加熱(Ohmic heating)，也叫電阻熱(Resistance h

10、eating)，焦耳加熱(Joule heating)，是食品加工領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)。其原理是利用交流電流通過(guò)液體內(nèi)部產(chǎn)生的電阻抗特性加熱。特點(diǎn)是沒(méi)有傳熱面(或很小)，不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)換熱器在高溫下易結(jié)垢、結(jié)焦的現(xiàn)象。本研究通過(guò)對(duì)電熱絲加熱和歐姆加熱的比較，探討了歐姆加熱方式在該系統(tǒng)中的應(yīng)用特性，建立了歐姆加熱的使用方法，使液體溫度在25s內(nèi)達(dá)到98—100℃。 但加熱產(chǎn)生的氣泡對(duì)光電傳感器電壓信號(hào)有較大的干擾。特別是加熱產(chǎn)生的大

11、氣泡能引起電壓信號(hào)的突變，其變化量接近或超過(guò)滴定終點(diǎn)的電壓變化，造成滴定終點(diǎn)誤判。本系統(tǒng)中，滴定液經(jīng)加熱套預(yù)加熱，使溫度達(dá)到50—60℃后進(jìn)入反應(yīng)池，大大減少了反應(yīng)池內(nèi)加熱電極的加熱強(qiáng)度，減少了突發(fā)性大氣泡的產(chǎn)生。同時(shí)，該系統(tǒng)中連接光源和光電轉(zhuǎn)換器之間有一個(gè)多孔的光通道，在攪拌的作用下，反應(yīng)液體和小氣泡可以均勻透過(guò)，而液體中大氣泡不能直接通過(guò)。小氣泡也能引起電壓信號(hào)變化，但其變化量不足滴定終點(diǎn)時(shí)的1/30，且分布均勻，不會(huì)引起檢測(cè)器電壓

12、的突變。在終點(diǎn)時(shí)，指示劑次甲級(jí)蘭的顏色消失引起的光電電壓變化明顯高于氣泡引起的變化。因此，加熱氣泡不會(huì)干擾光電信號(hào)的采集。 針對(duì)發(fā)酵樣品的特殊性和試驗(yàn)過(guò)程中遇到的問(wèn)題，設(shè)計(jì)出還原糖傳感器電路和控制軟件，設(shè)計(jì)出微型反應(yīng)池和相應(yīng)的測(cè)試系統(tǒng)硬件；研究了以LED光電檢測(cè)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的斐林試劑測(cè)定還原糖的光學(xué)響應(yīng)特征、光度測(cè)定的抗干擾性能；建立了還原糖測(cè)定方法和淀粉糖化過(guò)程的在線檢測(cè)技術(shù)。傳感器性能指標(biāo)達(dá)到以下要求： 1、傳感器

13、操作簡(jiǎn)單，測(cè)定時(shí)只需用微量注射器將被測(cè)樣品注入反應(yīng)池即可全自動(dòng)完成；測(cè)定速度快，測(cè)定時(shí)間在3-4分鐘；結(jié)果準(zhǔn)確，還原糖在0-1.0％范圍內(nèi)，線形相關(guān)系數(shù)為0.9998，精密度(RSD％)為1.14(n=10)；抗干擾能力強(qiáng)，樣品不需要過(guò)濾、脫色處理可直接測(cè)定，回收率為98-103％；測(cè)試成本較低，試劑消耗量低于常規(guī)滴定方法。 2、在線檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)10.0％還原糖樣品連續(xù)測(cè)定精密度(RSD％)為2.32(n=10)：還原糖在0-18

14、％范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.9932；在線檢測(cè)滯后時(shí)間小于7分鐘。在實(shí)際生產(chǎn)中可連續(xù)33小時(shí)自動(dòng)測(cè)定淀粉糖化生產(chǎn)過(guò)程還原糖變化，系統(tǒng)運(yùn)行正常。 在以上研究基礎(chǔ)上，將還原糖測(cè)定與葡萄糖酶電極測(cè)定技術(shù)相結(jié)合，初步研究了谷氨酸發(fā)酵過(guò)程微生物對(duì)葡萄糖、還原糖的代謝規(guī)律和淀粉糖化過(guò)程葡萄糖、還原糖的變化特點(diǎn)。 對(duì)13個(gè)淀粉糖化樣品的測(cè)試結(jié)果表明：糖化樣品DE值在95以上，且顏色淺，透光率好，按常規(guī)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)衡量基本一致。但樣品中葡

15、萄糖/還原糖值變化較大。葡萄糖/還原糖比值變化從80％-94.2％；其中，11、12號(hào)樣品還原糖含量差別僅有0.2％，而葡萄糖/還原糖比值相差8％以上。 對(duì)谷氨酸發(fā)酵過(guò)程還原糖和葡萄糖含量變化的測(cè)定結(jié)果顯示：發(fā)酵開始時(shí)，發(fā)酵液中還原糖含量高于葡萄糖1.09％：葡萄糖/還原糖為92％；在0.8小時(shí)之間，還原糖代謝速率為0.215％，葡萄糖為0.225％；8小時(shí)以后，谷氨酸發(fā)酵代謝速率明顯提高，在10-24小時(shí)，還原糖與葡萄糖平均