納米技術(shù)在血紅蛋白自組裝及電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、21世紀(jì)，納米科學(xué)和技術(shù)已經(jīng)成為人們關(guān)注和研究的重要領(lǐng)域。當(dāng)物質(zhì)的尺寸小到納米數(shù)量級(jí)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等，其電學(xué)、磁學(xué)、光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)也會(huì)相應(yīng)地發(fā)生顯著變化，呈現(xiàn)出常規(guī)材料所不具備的優(yōu)越性能。
　　 蛋白質(zhì)和酶等生物大分子是構(gòu)成生命的主要單元，參與完成生命體中的新陳代謝等許多生理過(guò)程，同時(shí)在這些生命過(guò)程中很多蛋白質(zhì)和酶都要經(jīng)歷電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，在其氧化型和還原型之間相互轉(zhuǎn)化。從某種意義

2、上講，研究生命過(guò)程實(shí)質(zhì)上就是研究生物體中的電子傳遞過(guò)程。因此，用電化學(xué)方法來(lái)研究蛋白質(zhì)的電子傳遞過(guò)程有其特殊的優(yōu)越性。
　　 氧化還原蛋白質(zhì)在電極上的電化學(xué)研究是化學(xué)界和生命科學(xué)界非常關(guān)注的問(wèn)題。它的研究對(duì)于人們獲得蛋白質(zhì)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、深入認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)和酶等生物大分子在生命體內(nèi)的生理作用及電子傳遞反應(yīng)機(jī)制以及開發(fā)新型生物傳感器、新型生物燃料電池等生物電子器件具有重要意義。因此，尋找更有效的方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移、通過(guò)

3、研究蛋白質(zhì)的電子傳遞以進(jìn)一步揭示生物體系氧化還原過(guò)程的機(jī)制、構(gòu)建性能優(yōu)越的生物傳感器以滿足生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測(cè)和工業(yè)快速分析的需要，必將成為該領(lǐng)域今后的發(fā)展趨勢(shì)。
　　 納米材料具有高比表面積、高表面自由能以及優(yōu)良的生物相容性等這些獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，它能活化電極表面，滲透到蛋白質(zhì)內(nèi)部并接觸蛋白質(zhì)的電活性中心，從而縮短蛋白質(zhì)活性中心與電極表面的距離，加快直接電子傳遞的速度，同時(shí)能最大限度地保持蛋白質(zhì)的生物活性。
　　 因

4、此，對(duì)納米界面上的生物大分子的直接電化學(xué)和電催化過(guò)程及其機(jī)理展開研究，以獲得一系列具有高靈敏度和超高選擇性的生物傳感器及其分子器件，可以為生命科學(xué)提供有價(jià)值的檢測(cè)手段，同時(shí)也能為揭示某些生物分子的生理功能提供科學(xué)信息。
　　 本論文的工作是導(dǎo)師顧海鷹教授主持的國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目和作者主持的國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目的部分工作內(nèi)容，在對(duì)納米材料、氧化還原蛋白質(zhì)的電化學(xué)研究及電化學(xué)生物傳感器等方面進(jìn)行論述的基礎(chǔ)上，致力于研制新型

5、納米材料和納米修飾電極（電化學(xué)傳感器），以納米銀、殼核型磁性納米粒子、石墨烯等多種納米材料作為血紅蛋白的反應(yīng)平臺(tái)，構(gòu)筑可以加速血紅蛋白與電極間電子轉(zhuǎn)移過(guò)程的單層和多層組裝膜修飾電極。以電化學(xué)方法作為主要研究手段，結(jié)合多種表征方法，探討血紅蛋白在納米材料修飾電極上的電化學(xué)行為，既獲取了血紅蛋白電子轉(zhuǎn)移的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，也為研制無(wú)媒介體的生物傳感器提供了初步模型。另外，對(duì)基于血紅蛋白/納米粒子層層組裝膜的pH開關(guān)進(jìn)行了初步的探索，實(shí)現(xiàn)了由溶液p

6、H值調(diào)控的可逆電催化。同時(shí)，開展了環(huán)境中酚類雌激素電化學(xué)傳感器的研究，建立了基于納米材料的新型電化學(xué)檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，為環(huán)境科學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的研究提供許多重要的分析方法。本論文工作努力實(shí)現(xiàn)將納米技術(shù)、生命科學(xué)和電分析化學(xué)三者的有機(jī)結(jié)合。主要結(jié)果如下：
　　 1.血紅蛋白在銀納米粒子上的自組裝、表征及應(yīng)用
　　 將血紅蛋白(Hb）組裝在銀納米粒子(AgNPs)-殼聚糖膜修飾的玻碳電極表面，并基于該修飾電

7、極研究了Hb的直接電化學(xué)及其在生物傳感方面的應(yīng)用。AgNPs能極大程度地提高Hb在電極表面的電子傳遞。在pH7.0的磷酸緩沖溶液(PBS)中，Hb呈現(xiàn)一對(duì)峰形良好的氧化還原峰，式量電位(Eo’)為-0.33V(vs.SCE)。固定在薄膜上的Hb保持了其生物活性，其電子轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為一個(gè)表面控制過(guò)程，異相電荷轉(zhuǎn)移常數(shù)(Ks)為1.83s-1。在對(duì)氧氣(O2)和過(guò)氧化氫(H2O2)的電催化還原反應(yīng)中表現(xiàn)出類過(guò)氧化氫酶的性質(zhì)，對(duì)H2O2測(cè)定的線性

8、范圍為7.5×10-7-2.2×10-4mol/L，檢測(cè)限為5.0×10-7mol/L(S/N=3)。這種簡(jiǎn)單的組裝方法可以為進(jìn)一步研究其他氧化還原蛋白的直接電化學(xué)提供一個(gè)有利的平臺(tái)，并可用于構(gòu)建第三代無(wú)媒介體的生物傳感器。
　　 2.血紅蛋白在金包四氧化三鐵納米粒子表面的直接電化學(xué)
　　 將合成的金包四氧化三鐵(Au@Fe3O4)納米粒子與Hb組裝在電化學(xué)預(yù)處理玻碳電極表面，構(gòu)建了{(lán)Sb/Au@Fe3O4}自組裝膜。H

9、b在該納米薄膜上實(shí)現(xiàn)了其直接電子轉(zhuǎn)移。用透射電子顯微鏡(TEM)和原子力顯微鏡(AFM)對(duì)合成的Au@Fe3O4納米粒子進(jìn)行了表征，用電化學(xué)交流阻抗(EIS)、循環(huán)伏安法(CV)研究了Hb和Au@Fe3O4納米粒子之間的相互作用。在pH7.0的PBS緩沖溶液中，在-0.35V和-0.13V處可觀察到Hb的一對(duì)峰形良好的氧化還原峰。另外，組裝的Hb對(duì)H2O2的還原表現(xiàn)出良好的電催化活性。催化電流與H2O2濃度在3.4μmol/L-3.6m

10、mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.68μmol/L(S/N=3)，米氏常數(shù)(Kmapp)約為2.0mmol/L，有望用于構(gòu)建第三代H2O2生物傳感器。
　　 3.{血紅蛋白/鉑包四氧化三鐵｝n多層膜的構(gòu)建、表征及應(yīng)用
　　 利用層層組裝技術(shù)將合成的鉑包四氧化三鐵(Pt@Fe3O4)納米粒子與Hb層層組裝到玻碳電極表面，構(gòu)建{血紅蛋白/鉑包四氧化三鐵｝n多層膜。合成的復(fù)合納米粒子通過(guò)X射線光電子能譜(XPS)來(lái)

11、表征。紫外可見(jiàn)光譜(UV-vis)，EIS，CV以及AFM用來(lái)表征多層膜的組裝過(guò)程，結(jié)果表明多層膜的形成是一個(gè)規(guī)則有序的過(guò)程。同時(shí)，{Hb/Pt@Fe3O4｝n多層膜中的Hb保持了其良好的生物活性，并實(shí)現(xiàn)了其與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移，且對(duì)H2O2和亞硝酸鹽保持著很好的催化活性。對(duì)H2O2與亞硝酸鹽的檢測(cè)的線性范圍分別為0.125μmol/L-0.16mmol/L和1.5μmol/L-0.12mmol/L，檢測(cè)限分別為0.03μmol/L

12、和0.29μmol/L(S/N=3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，層層組裝由于其組裝膜表面吸附了更多的生物分子，因而在構(gòu)建高靈敏度的無(wú)媒介傳感器方面更有優(yōu)勢(shì)。
　　 4.基于{血紅蛋白/銀納米粒子}n多層組裝膜的pH開關(guān)效應(yīng)
　　 在合適的pH值下，將帶正電荷的Hb與帶負(fù)電荷的AgNPs交替吸附，構(gòu)建了具有pH開關(guān)性質(zhì)的層層自組裝膜。該{Hb/AgNPs}n膜對(duì)于電活性探針Fe(CN)63-具有很強(qiáng)的pH敏感開-關(guān)效應(yīng)。在pH值為3.

13、0時(shí)，{Hb/AgNPs}4膜對(duì)于帶負(fù)電荷的探針Fe(CN)63-有電化學(xué)響應(yīng)，表現(xiàn)為“開”的狀態(tài)，而在pH為9.0時(shí)，該多層膜對(duì)探針沒(méi)有響應(yīng)，表現(xiàn)為“關(guān)”的狀態(tài)。完全可逆的開關(guān)行為可以簡(jiǎn)單地通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)實(shí)現(xiàn)，且該開關(guān)行為可以應(yīng)用于pH控制的Hb對(duì)H2O2可逆電催化。實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的具有pH靈敏的開關(guān)智能界面有望為制備具有信號(hào)控制功能的特殊電化學(xué)生物傳感器提供一個(gè)新的思路。
　　 5.亞硝酸鹽在金包四氧化三鐵納米粒子上的電

14、催化氧化及其測(cè)定
　　 通過(guò)將Au@Fe3O4納米粒子固定在L-半胱氨酸修飾的玻碳電極表面構(gòu)建一種亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器，并用掃描電子顯微鏡(SEM)、XPS、EIS和CV進(jìn)行表征。該傳感器對(duì)亞硝酸鹽的氧化具有良好的電催化活性。對(duì)電極反應(yīng)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，(1-a)na為0.38，ks為0.13cm/s。對(duì)測(cè)定條件如支持電解質(zhì)及其pH值進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，亞硝酸鹽測(cè)定的線性范圍為3.6×10-6-1.0×10-2mo

15、l/L，檢測(cè)限為8.2×10-7mol/L(S/N=3)。此外，構(gòu)建的電極在實(shí)際應(yīng)用中顯示出良好的穩(wěn)定性，重現(xiàn)性和選擇性。
　　 6.基于殼聚糖-四氧化三鐵納米復(fù)合物的雙酚A電化學(xué)傳感器
　　 研究了用殼聚糖-四氧化三鐵(CS-Fe3O4)納米材料修飾玻碳電極對(duì)雙酚A(BPA)進(jìn)行安培測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CS-Fe3O4復(fù)合納米粒子可以顯著增強(qiáng)BPA的電流反應(yīng)，同時(shí)降低其氧化過(guò)電位。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了測(cè)定參數(shù)如修飾劑的量、富集電位、

16、富集時(shí)間及緩沖溶液的pH值等。在優(yōu)化條件下，BPA的氧化峰電流與其濃度在5.0×10-8mol/L-3.0×l0-5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為8.0×10-8mol/L(S/N=3)。將構(gòu)建的傳感器成功地應(yīng)用于塑料產(chǎn)品中BPA的測(cè)定，加標(biāo)回收率在92.0％到106.2％之間。
　　 7.己烯雌酚在石墨烯修飾電極上的電化學(xué)行為及其測(cè)定
　　 將氧化石墨烯(GO)組裝在電沉積殼聚糖膜的玻碳電極表面，構(gòu)建的修飾

17、電極對(duì)己烯雌酚(DES)進(jìn)行了伏安測(cè)定。實(shí)驗(yàn)研究了DES在該修飾電極上的電化學(xué)行為。與玻碳電極相比，DES在GO-CS/GCE上的氧化峰電流顯著增強(qiáng)。在優(yōu)化條件下，修飾電極對(duì)于DES的氧化表現(xiàn)出良好的電催化活性。采用示差脈沖伏安法，測(cè)定DES的線性范圍為1.5×l0-8-3.0×l0-5mol/L，最低檢測(cè)線達(dá)到3.0×10-9mol/L。并用該方法測(cè)定了DES片劑中的DES含量。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)提出的測(cè)定方法可用于實(shí)際樣品中DES的檢測(cè)。