血紅蛋白及血紅素結(jié)構(gòu)的光譜和電化學(xué)研究.pdf

1、以血紅素為活性中心的氧化還原蛋白酶直接電化學(xué)的研究是目前生物電化學(xué)研究的熱點(diǎn),比如血紅蛋白(Hb)、肌紅蛋白(Mb)、辣根過氧化物酶(HRP)、過氧化氫酶(CAT)、細(xì)胞色素c(Cty c)等蛋白酶在電化學(xué)方面的研究報道有很多。通過研究血紅素蛋白酶與電極間的電子傳遞過程,可以了解生物體內(nèi)電子傳遞機(jī)理和生理作用機(jī)理,也為第三代蛋白酶生物傳感器的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。人工模擬生物體內(nèi)蛋白酶的方法技術(shù)對解決天然蛋白酶的局限性以及代替天然蛋白酶用

2、于生物學(xué)和化學(xué)分析等都很重要的意義。
　　本實(shí)驗(yàn)采用高分子納米復(fù)合功能化材料將血紅蛋白固定在玻碳電極上,通過循環(huán)伏安法研究了血紅蛋白的直接電化學(xué)特性,采用線性掃描和時間電流測試了修飾電極對過氧化氫(H2O2)的催化響應(yīng)。結(jié)果表明:血紅蛋白受電極表面控制影響,血紅蛋白被成功固定在電極表面并能進(jìn)行有效地直接電子轉(zhuǎn)移,血紅蛋白與電極之間氧化還原反應(yīng)為單電子傳遞過程,電子傳遞率ks為4.2±0.2 s-1;通過電流時間法測試出該電極能保持

3、對H2O2還原的生物催化活性對 H2O2有響應(yīng),其檢測范圍為0.05~1 nM,最低檢測限為0.05(±0.01 nM)。測得血紅蛋白的表觀米氏常數(shù)Kmapp為0.85(±0.1) nM。實(shí)現(xiàn)了對H2O2高靈敏度低檢測限的檢測,為研制出第三代痕量H2O2生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)采用半合成酶制備的原理,用內(nèi)部疏水的SDS結(jié)構(gòu)模擬酶的外部結(jié)構(gòu),用小分子的血紅素和組氨酸模擬酶的內(nèi)部催化活性結(jié)構(gòu),通過自組裝的方式以天然辣根過氧化

4、物酶(HRP)為特征構(gòu)建了人工過氧化物酶,模擬其催化活性并應(yīng)用于生物電化學(xué)的研究。
　　首先,本工作采用光譜學(xué)法對由50 mM SDS納米膠團(tuán)和10μM血紅素(heme)-50 mM組氨酸(His)溶液自組裝構(gòu)建的人工過氧化物酶的催化能力、結(jié)構(gòu)、酶動力學(xué)、自殺性失活進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定人工過氧化物酶、heme及天然HRP的表觀催化活性,觀察到了人工過氧化物酶具有良好的催化過氧化氫及愈創(chuàng)木酚發(fā)生氧化反應(yīng)的活性

5、,且人工過氧化物酶在pH8.0時表現(xiàn)出較高的表觀活性;在臨界膠團(tuán)濃度(CMC)以上,SDS膠團(tuán)的濃度對人工過氧化物酶的活性幾乎沒有影響,組氨酸濃度對人工過氧化物酶的活性有一定影響,在一定濃度范圍內(nèi)會隨著His濃度增加而增加;測試得到其具有可觀的催化效率,其中酶動力學(xué)參數(shù)Km值為5.5μM,催化速率常數(shù)為0.06s-1,人工過氧化物酶催化效率為0.011μM-1s-1,相當(dāng)于天然HRP催化效率的15％。本文還測試了人工過氧化物酶在高濃度

6、H2O2下的穩(wěn)定性,數(shù)據(jù)顯示人工過氧化物酶會隨著H2O2濃度的增加反應(yīng)速度增加,在酸性環(huán)境中,人工過氧化物酶對高濃度H2O2抵抗能力強(qiáng),但反應(yīng)速度比較慢;而人工過氧化物酶在堿性環(huán)境中,抵抗底物自殺性失活能力比較弱,但酶反應(yīng)速度最快,說明低pH溶液有助于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,高pH溶液有利于活性的提高。
　　再者,采用電化學(xué)分析法對人工過氧化物酶的電化學(xué)特性進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)將人工過氧化物酶固定在高分子納米復(fù)合材料修飾的玻碳電極上。通過循環(huán)伏安