鹽酸小檗堿對(duì)NAFLD大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)性研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)，是指除外飲酒及其他明確的肝損傷因素，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要病理學(xué)特點(diǎn)的臨床綜合征。根據(jù)肝脂肪變及嚴(yán)重程度，NAFLD可分為單純性脂肪肝(Simple fatty liver, SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)及其相關(guān)肝硬化。通常，NAFLD被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟代謝紊

2、亂的表現(xiàn)。目前NAFLD的治療沒有特效的藥物，包括體育鍛煉、飲食調(diào)節(jié)、減肥等生活方式的改變是預(yù)防和治療NAFLD的基本方法。
　　人體內(nèi)的腸道菌群種類繁多，功能復(fù)雜，其對(duì)于維持人類機(jī)體的內(nèi)環(huán)境平衡與正常代謝至關(guān)重要。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與肥胖癥、NAFLD等代謝性疾病的關(guān)系愈加密切。高脂飲食可引起腸道內(nèi)致病菌數(shù)量增加，腸道固有益生菌數(shù)量降低，緊密連接蛋白表達(dá)減少，腸黏膜通透性增加，血清內(nèi)毒素水平升高。對(duì)于高脂飲食導(dǎo)致肥胖癥患者

3、體內(nèi)存在慢性系統(tǒng)性炎癥的原因，“代謝性內(nèi)毒素血癥”這一假說做出了很好的解釋。另外，腸道菌群可以將宿主不能消化的食物分解為短鏈脂肪酸(Short chainfatty acid，SCFA)，促進(jìn)宿主對(duì)脂肪的儲(chǔ)存和吸收。因此，揭示腸道菌群在相關(guān)代謝性疾病中的作用機(jī)制，對(duì)NAFLD的預(yù)防和治療意義重大。
　　鹽酸小檗堿俗稱黃連素，主要存在于毛莨科植物黃連根莖中，可以從黃連、黃柏、三棵針中提取，是我國(guó)應(yīng)用已久的中藥。鹽酸小檗堿抑菌效果顯著

4、，一般用來治療急性胃腸炎和細(xì)菌性痢疾。近年來，小檗堿的多種生理藥理作用被發(fā)掘出來。人們發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿有改善胰島素抵抗、降低膽固醇、抗心律失常、治療代謝綜合征等多種潛在的應(yīng)用價(jià)值。而且，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鹽酸小檗堿可以顯著的改善腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)。本研究以腸道菌群為切入點(diǎn)，探討了鹽酸小檗堿改善NAFLD大鼠腸黏膜屏障功能的作用機(jī)制，為鹽酸小檗堿治療NAFLD及其進(jìn)一步臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　目的:研究鹽酸小檗堿對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFL

5、D大鼠腸黏膜屏障的影響，探討鹽酸小檗堿改善NAFLD大鼠腸黏膜屏障功能的療效及可能的機(jī)制。
　　方法:雄性Sprague-Dawley大鼠24只(體重180g-200g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(Control group，CON組)(n=8)，高脂飲食組(High-fat diet group，HFD組)(n=8)，高脂飲食+小檗堿治療組(Berberine-treatment group，BBR組)(n=8

6、)。CON組給予普通飼料喂養(yǎng)，HFD組及BBR組予以高脂飼料喂養(yǎng)。大鼠自由飲水和進(jìn)食。喂食8周后，BBR組給予150mg/(kg.d)鹽酸小檗堿灌胃，CON組與HFD組給予相同容量的生理鹽水灌胃，治療4周后處死各組大鼠。
　　完整取出大鼠肝臟，稱取濕重，計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/總體重×100％);大鼠肝臟蘇丹黑B染色觀察大鼠肝臟脂肪變情況;全自動(dòng)生化分析儀分析各組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，AL、

7、)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)及甘油三酯(Triglyceride，TG)水平;HE染色觀察大鼠回腸末端黏膜上皮絨毛變化;免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察大鼠腸絨毛上皮細(xì)胞occludin蛋白的表達(dá)情況;鱟試劑法定量檢測(cè)血漿中內(nèi)毒素水平;采用平衡法測(cè)量血清中TNF-α水平;雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定大鼠血漿中腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(Intestine fatty acid bindingp

8、rotein，I-FABP)水平;應(yīng)用16S rDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR，RT-PCR)法測(cè)量大鼠糞便中普拉梭菌及擬桿菌的拷貝數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠體重(g)、肝指數(shù)(％)變化:喂養(yǎng)12周后稱重，HFD組大鼠體重(485.24±50.15)、肝指數(shù)(3.67±0.22)較CON組大鼠體重(379.83±61.51)、肝指數(shù)(2.56±0.18)明顯升高;與HFD組比較，BBR組體重(428.

9、60±37.37)、肝指數(shù)(2.91±0.27)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、大鼠血清ALT(U/L)、AST(U/L)、TG(mmol/L)變化:HFD組大鼠血清TG(0.437±0.027)、ALT(115.58±22.54)、AST(203.35±28.23)水平較CON組血清TG(0.344±0.038)、ALT(35.96±12.69)、AST(125.60±23.76)水平均顯著升高;與HFD組比較，BBR組血

10、清TG(0.377±0.047)、ALT(80.94±21.16)、AST(155.79±35.95)水平均顯著下降。
　　3、大鼠標(biāo)本病理學(xué)改變:肝臟行蘇丹黑B染色后觀測(cè)到HFD組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的紫黑色脂質(zhì)沉積，細(xì)胞脂肪變性廣泛;CON組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常。BBR組肝臟脂質(zhì)沉積及脂肪變性程度較HFD組減輕;HE染色觀察回腸黏膜上皮絨毛示CON組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列整齊。HFD組腸絨毛排列紊亂，部分缺失

11、。BBR組腸黏膜絨毛排列較整齊，無明顯萎縮，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少。
　　4、大鼠內(nèi)毒素(EU/ml)、I-FABP(pg/ml)、TNF-α(ng/ml)變化:HFD組大鼠內(nèi)毒素(0.288±0.045)、I-FABP(231.22±56.31)水平顯著高于CON組(0.192±0.049)、(136.95±57.52);與HFD組比較，BBR組大鼠內(nèi)毒素(0.213±0.025)、I-FABP(145.66±52.72)水平顯著降低

12、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HFD組大鼠TNF-α水平(1.07±0.11)較CON組(0.94±0.07)顯著升高，BBR組大鼠TNF-α水平(1.00±0.07)與HFD組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、大鼠標(biāo)本免疫組織化學(xué):CON組大鼠腸黏膜上皮occludin蛋白連續(xù)均勻的表達(dá)于黏膜上皮細(xì)胞連接處頂端(0.166±0.014)，HFD組(0.05±0.012)較CON組表達(dá)明顯減少，分布不均，兩組比較差異顯著。與HFD組相比，B

13、BR組(0.55±0.009)黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)occludin蛋白表達(dá)增多，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6、大鼠腸道菌群變化（拷貝數(shù)儋濕便）:HFD組大鼠糞便普拉梭菌(7.29±0.47)數(shù)量較CON組(6.53±0.35)、BBR組(6.72±0.34)顯著升高，CON組與BBR組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;HFD組大鼠糞便擬桿菌數(shù)量(8.70±0.62)降低，與CON組(9.49±0.59)相比差異顯著。經(jīng)鹽酸小檗堿治療后，BBR組