明膠-聚乳酸納米纖維三維多孔支架的制備及應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨組織再生.pdf

1、創(chuàng)傷、新陳代謝疾病和關(guān)節(jié)感染等引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損已成為臨床常見疾病之一。成熟的關(guān)節(jié)軟骨沒有血管組織，因此，一旦損傷，其自我修復(fù)能力非常有限。傳統(tǒng)治療關(guān)節(jié)軟骨缺損和疾病的方法如關(guān)節(jié)清創(chuàng)術(shù)、微骨折技術(shù)和軟骨移植等都存在各自的一些缺陷，例如，微骨折技術(shù)不能完全修復(fù)軟骨組織，軟骨移植存在供體有限的局限。因此，尋求可靠、安全和有效的修復(fù)軟骨缺損的方法具有重要的意義。近年來，利用組織工程的方法修復(fù)、替代受損軟骨組織為治療軟骨缺損和疾病帶來了新的思路

2、。組織工程軟骨支架作為種子細(xì)胞臨時(shí)生長的微環(huán)境，在軟骨組織工程中扮演了非常重要的角色。理想的軟骨組織工程支架應(yīng)提供一定的力學(xué)支撐，可以仿生天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，模擬軟骨細(xì)胞生長的微環(huán)境，利于軟骨細(xì)胞等種子細(xì)胞的粘附、生長和增殖，從而促進(jìn)軟骨缺損的修復(fù)。納米纖維結(jié)構(gòu)的支架被認(rèn)為可以仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)制備納米纖維支架的主要制備方法主要有靜電紡絲、相分離和自組裝等。但是這些技術(shù)都有自身的不足和局限，例如，靜電紡絲技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在

3、于制備二維結(jié)構(gòu)的納米纖維膜，在制備三維結(jié)構(gòu)的納米纖維支架方面仍然面臨挑戰(zhàn)。針對(duì)傳統(tǒng)納米纖維支架制備技術(shù)的不足，本課題將靜電紡技術(shù)與冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合，以Gelatin和PLA兩種生物相容性優(yōu)異的可降解材料為支架構(gòu)建材料，制備出 Gelatin占主體的納米纖維三維多孔支架。三維支架的制備思路可概括為：（1）靜電紡絲制備Gelatin與PLA復(fù)合的納米纖維膜；（2）將纖維膜剪碎，置于叔丁醇中利用高速勻漿機(jī)將纖維分散均勻；（3）冷凍干燥成型;

4、（4）交聯(lián)三維支架；此外，對(duì)三維支架進(jìn)行功能化修飾以進(jìn)一步提高三維支架的生物相容性。然后，表征三維支架的理化性能，檢測(cè)三維支架的細(xì)胞相容性。最后，評(píng)價(jià)三維支架植入動(dòng)物體內(nèi)后修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的效果。
　　首先，我們制備了基于戊二醛交聯(lián)的Gelatin/PLA納米纖維多孔支架，驗(yàn)證靜電紡絲與冷凍干燥相結(jié)合的三維支架制備技術(shù)的可行性。通過控制物料含量制備了不同密度的三維支架，隨著物料含量的增大，三維支架因戊二醛交聯(lián)導(dǎo)致的體積收縮率降低。由掃

5、描電子顯微鏡（SEM）觀察到三維支架的纖維形貌和多孔結(jié)構(gòu)，表明支架具有仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的效果。吸水率實(shí)驗(yàn)測(cè)試表明三維支架具有優(yōu)異的吸水性能，且最大吸水率隨著物料含量的增加而降低。分別對(duì)干態(tài)下和濕態(tài)下的三維支架進(jìn)行壓縮力學(xué)測(cè)試，結(jié)果表明，隨著支架物料含量的增加，三維支架的力學(xué)強(qiáng)度增加，此外，濕態(tài)下的三維支架呈現(xiàn)出壓縮彈性，在一定的壓力下將支架壓縮至80％形變，當(dāng)撤掉外力時(shí)，支架又可以吸水慢慢恢復(fù)原狀。將三維支架與成纖維細(xì)胞共培

6、養(yǎng)，通過MTT增殖實(shí)驗(yàn)表明三維支架可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長和增殖，通過SEM觀察表明細(xì)胞在支架上生長可以保持很好的細(xì)胞形貌，通過對(duì)支架進(jìn)行切片和HE染色，可以觀察到細(xì)胞已經(jīng)長入到支架的內(nèi)部。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靜電紡技術(shù)與冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合制備組織工程支架的方法具有可行性。
　　然后，為了避免Gelatin/PLA三維支架因戊二醛交聯(lián)帶來的毒性，我們采用熱交聯(lián)和水處理兩步法代替戊二醛交聯(lián)。探討了不同加熱溫度對(duì)三維支架力學(xué)和支架形貌穩(wěn)

7、定性的影響，找到了合適的熱交聯(lián)溫度。研究發(fā)現(xiàn)熱處理后三維支架的力學(xué)強(qiáng)度增加，而當(dāng)熱處理支架吸水后再次冷凍干燥后，其力學(xué)強(qiáng)度將進(jìn)一步提高。兩步法處理的三維支架與戊二醛交聯(lián)支架相似，具有納米纖維構(gòu)成的多孔結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的吸水性能和濕態(tài)下的壓縮彈性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，三維支架可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長和增殖，保持較好的細(xì)胞活性，表明熱交聯(lián)三維支架具有較好的生物相容性。
　　為了進(jìn)一步模擬天然軟骨基質(zhì)的化學(xué)組成，我們對(duì) Gelatin/PLA三維支架

8、進(jìn)行修飾，將透明質(zhì)酸（HA）通過 EDC/NHS接枝于三維支架纖維的表面。研究發(fā)現(xiàn)三維支架經(jīng)HA修飾后其密度增加，而纖維形貌和吸水性能變化不大。壓縮力學(xué)表明三維支架經(jīng) HA修飾后，無論是在干態(tài)下還是濕態(tài)下，支架的壓縮力學(xué)強(qiáng)度都顯著提高，表明HA的加入使得三維支架的―硬度‖增強(qiáng)。為了評(píng)價(jià)三維支架在動(dòng)物體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果，我們制造新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，并將HA修飾支架和未修飾支架分別植入軟骨缺損處。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)HA修

9、飾的三維支架可以明顯促進(jìn)大白兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，而未修飾三維支架修復(fù)軟骨缺損的效果一般。
　　最后，我們制備了一種主要由槽狀纖維構(gòu)成的三維多孔支架。該支架是利用同軸靜電紡技術(shù)制備PLA位于芯層，Gelatin位于殼層的PLA@Gelatin納米纖維膜。納米纖維膜在高速勻漿機(jī)的力學(xué)攪拌作用下，PLA從纖維內(nèi)部脫離，從而形成槽狀Gelatin短纖維和PLA纖維，以此為材料構(gòu)成的三維支架由熱交聯(lián)和水處理后同樣具有多孔結(jié)構(gòu)，優(yōu)異的吸水性

10、能和濕態(tài)下壓縮彈性。我們進(jìn)一步對(duì) PLA@Gelatin三維支架進(jìn)行功能化修飾，選用軟骨基質(zhì)中含有的另一種成分——硫酸軟骨素（CS）通過 EDC/NHS接枝于支架纖維表面。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CS修飾后的支架可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）向軟骨細(xì)胞分化，此外，動(dòng)物結(jié)果表明，CS修飾支架比未修飾支架更有利于新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)。
　　綜上所述，我們利用多種技術(shù)相結(jié)合制備出了多種仿生軟骨組織工程支架。靜電紡技術(shù)制備出納米纖維，