羧基化多壁碳納米管在小鼠體內(nèi)的急性毒性研究.pdf

1、本課題的目的和意義： 目前采用靜脈注射的的方式研究CNTs體內(nèi)毒性的報(bào)道較少。基于此，我們首先開展了靜脈注射羧基化多壁碳納米管在小鼠體內(nèi)急性毒性的研究。本文通過組織病理學(xué)評(píng)價(jià)以及血清生化指標(biāo)的分析，較系統(tǒng)的研究了羧基化多壁碳納米管在小鼠體內(nèi)的急性毒性，并比較了不同團(tuán)聚程度的羧基化多壁碳納米管在小鼠體內(nèi)行為的不同。為進(jìn)一步探討CNTs的體內(nèi)行為、毒性及作用機(jī)制提供依據(jù)。 方法： 1.羧基化多壁碳納米管的制備多壁碳納

2、米管(MWNT) (直徑l0nm或40nm)置于1:3混合的HNO3/H2SO4溶液中，60℃下超聲3h。倒入大量去離子水中，得到良好分散的黑色溶液。將此溶液用0.22μm聚碳酸酯微孔濾膜過濾，用去離子水充分洗滌至濾液pH值為7.0。將濾膜上的碳管真空干燥24h獲得羧基化的多壁碳納米管(MWNT-COOH)粉末，產(chǎn)物用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)檢測(cè)分析。 2.MWNT-COOH分散性比較將10nm-MWNT-COOH加入PB

3、S中超聲l0min得到懸濁液A；將40nm-MWNT-COOH加入PBS中超聲10min得到懸濁液B；將l0nm-MWNT-COOH加入含有l(wèi)％的PBS中超聲10rain得到懸濁液C：將40nm.MWNT-COOH加入含有1％的PBS中超聲10rain得到懸濁液D。懸濁液A、B、C和D的終濃度為0.5mg/ml。通過比較幾種懸濁液的沉淀時(shí)間比較幾種懸濁液中MWNT-COOH的分散程度。 3.BCA方法測(cè)定MWNTs對(duì)小鼠血清蛋白

4、的吸附將直徑為1 0am的羧基化多壁碳納米管(10nm-MWNT-COOH)和直徑為40am的羧基化壁碳納米管(10nm-MWNT-COOH)分別分散于PBS緩沖液中，終濃度均為200ug/ml，超聲10min使MWNT-COOH達(dá)到均勻分散。將20ul稀釋的小鼠血清加至200ul碳納米管溶液中，混勻，室溫孵育2h，13 000g室溫離心10rain，取上清液。通過BCA法測(cè)定上清中蛋白含量。總蛋白與上清蛋白含量的差值即為MWNT-CO

5、OH所吸附的蛋白量。 4.急性毒性實(shí)驗(yàn)120只健康BALB/C小鼠(體重18-20g，購自山東大學(xué)動(dòng)物中心)經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，將其隨機(jī)分為A、B、C、D四組(n=30).采用以下方式分別經(jīng)尾靜脈一次性注射以下試劑(濃度為10ml/kg)，A組：在磷酸鹽緩沖液(PBS)中超聲l0rain均勻分散的10nm-MWNT-COOH，終濃度為0.5mg/mL；B組：在含有1％tween80的PBS中超聲10rain均勻分散40rim-M

6、WNT-COOH，終濃度為0.5mg/ml：C組：PBS對(duì)照組；D組：含有1％Tween 80的PBS對(duì)照組。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，溫度20±2℃，濕度(40·60)％。注射后對(duì)小鼠毛發(fā)、食欲、行為狀態(tài)及動(dòng)物死亡情況進(jìn)行觀察，每周稱體重1次。每組均設(shè)置三個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)，分別是第1天、7天和28天。于第1天和7天分別從每組隨機(jī)抽取10只小鼠，解剖后迅速摘取心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟，腦。肉眼觀察各臟器顏色和外觀后用10％福爾馬林將其

7、固定24h，用于制備病理切片。每組剩余的10只小鼠于第28天摘眼球取血(取血前禁食12h)，將小鼠全血3000g離心l0min去除血細(xì)胞。小心吸取上層血清-20℃冷凍保存待測(cè)。將小鼠解剖，迅速摘取心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟，腦。肉眼觀察各臟器顏色和外觀后用1 O％福爾馬林將固定24h，用于制備病理切片。 5.血清生化指標(biāo)的測(cè)定測(cè)定冷凍保存的小鼠血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(Cr)和尿素

8、氮(BUN)的含量。測(cè)定在全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行。 6.組織病理學(xué)切片(HE染色)的制備(具體步驟略)。 結(jié)果： 1.碳納米管對(duì)血清蛋白吸附的測(cè)定在同樣條件下，每毫克10nm-MWNT-COOH吸附的小鼠血清蛋白量為0.75mg，40nm-MWNT-COOH吸附的小鼠血清蛋白量為0.20mg。經(jīng)計(jì)算知10nm-MWNT-COOH吸附的血清蛋白為總量的39.85％，40nm-MWNT-C00H吸附的血清蛋白為總量的

9、10.75％。 2.MwNT-CooH分散性的比較我們通過觀察發(fā)現(xiàn)，懸濁液A中的10nm-MWNT-COOH的分散性最差，團(tuán)聚程度最高。通過對(duì)懸濁液B的觀察，發(fā)現(xiàn)通過1％Tween 80助溶也不能較大改善l0nm-MWNT-COOH的分散性。而懸濁液C中40nm-MwNT-COOH的分散性較好。1％Tween 80的加入更能夠較大改善40nm-MWNT-COOH的分散性。所以為了比較不同分散性MWNT-COOH對(duì)小鼠的記性毒性，

10、我們選取了懸濁液A和懸濁液D作為小鼠急性毒性的實(shí)驗(yàn)材料。 3.動(dòng)物行為的觀察與體重變化經(jīng)觀察受試組與對(duì)照組小鼠毛發(fā)光澤，體態(tài)活潑，反應(yīng)敏捷，食量、排泄物均正常。血液生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果受試組小鼠與對(duì)照組小鼠血清中的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(CR)和尿素氮(BUN)含量沒有顯著差異(P>0.05)5.動(dòng)物體重的變化對(duì)照組與受試組小鼠在四周內(nèi)體重變化的差異不顯著(P>0.05)。 4.病

11、理切片的結(jié)果肺部：A組：在暴露1d后，肺部切片中可見大量的黑色顆粒物，系10nm-MWNT-COOH積累于肺部毛細(xì)血管的團(tuán)聚物。隨著暴露時(shí)間的延長，10nm-MWNT-COOH在肺部的積累逐漸減少，但在暴露28d時(shí)在肺部仍然可查見大量的10nm-MWNT-COOH。相比之下，在1d、7d、2gd，B組、C和D組小鼠的肺部均未見黑色顆粒物存在，說明B組小鼠的肺部沒有40nm-MWNT-COOH的積累。各受試組與對(duì)照組碳納米管在28d內(nèi)未引

12、起小鼠肺部的組織病理學(xué)改變。氣管、各級(jí)支氣管及肺泡、肺泡間隔形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見充血、增生等形態(tài)學(xué)改變，肺泡內(nèi)也未見肺泡巨噬細(xì)胞增多。 肝臟：A組：暴露1d后小鼠的肝臟未見棕黑色點(diǎn)狀物的存在，但在暴露7d以及28時(shí)，肝臟組織中發(fā)現(xiàn)黑色顆粒物的積累，說明10nm-MWNT-COOH在肝臟中的積累是逐漸增多的。B組小鼠暴露1d時(shí)肝臟中可見大量的40nm-MWNT-COOH團(tuán)聚物，團(tuán)聚物的數(shù)量隨暴露時(shí)間的延長逐漸減少，在28d后肝臟中未

13、發(fā)現(xiàn)40nm-MWNT-COOH的團(tuán)聚物。所有暴露組與對(duì)照組肝小葉、肝竇、肝板及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，未見肝細(xì)胞變性壞死等形態(tài)學(xué)改變。 心臟：與對(duì)照組相比較，受試組小鼠(A組和B組)在暴露1d與7d后小鼠的心肌間質(zhì)中查見散在的炎細(xì)胞浸潤。在暴露28d時(shí)，心肌間質(zhì)也恢復(fù)正常，未見充血及炎癥等病理形態(tài)學(xué)改變。心內(nèi)膜、外膜、心肌及心肌間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維未見明顯變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變。 脾臟：受試組(A組和B組)小鼠在注射1d

14、和7d后小鼠脾臟的部分脾索中查見巨核細(xì)胞及多核巨細(xì)胞顯著增多。但未見組織病理學(xué)的改變。在暴露28d后脾臟中巨核細(xì)胞及多核巨細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常。 腦：所有受試組與對(duì)照組大腦皮層、小腦等結(jié)構(gòu)正常。血管輕度充血，未見水腫及腦軟化灶等改變。 腎臟：所有受試組皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，腎小體未見明顯充血及滲出等改變。 結(jié)論： 1.體外實(shí)驗(yàn)表明，與40nm-MWNT-COOH相比較，團(tuán)聚程度較大的10nm-MWNT-COOH容易

15、結(jié)合較多的小鼠血清蛋白。 2.MWNT-COOH的團(tuán)聚程度影響其在體內(nèi)的行為，分散于PBS中的l0rim-MWNT-COOH 的團(tuán)聚程度要高于分散于含有1％Tween80PBS中的40nm-MWNT-COOH。10nm-MWNT-COOH彼此相互吸附會(huì)形成較大的團(tuán)聚物，因此在通過尾靜脈注射進(jìn)入小鼠血液后，大量的團(tuán)聚物會(huì)堵塞于小鼠肺部的毛細(xì)血管中。隨著暴露時(shí)間的延長，積累在肺部的10nm-MWNT-COOH團(tuán)聚物有少量的清除，但在

16、暴露28d后，肺部仍有大量的10nm-MWNT-COOH團(tuán)聚物積累。而肝臟中10nm-MWNT-COOH團(tuán)聚物積累逐漸增加與肺部10nm-MWNT-COOH積累逐漸減少的趨勢(shì)說明從肺部清除的部分10nm-MWNT-COOH隨血液循環(huán)經(jīng)過肝臟時(shí)會(huì)被肝臟所吸收。肝臟中積累的10nm-MWNT-COOH團(tuán)聚物在28d后仍未清除。對(duì)于40nm-MWNT-COOH來說，由于其在1％Tween80的PBS中分散性較好，沒有形成大體積的團(tuán)聚物，因此其

17、在肺部沒有積累。但暴露1d后，在肝臟中可見較多的40rim-MWNT-COOH團(tuán)聚物，肝臟中40nm-MWNT-COOH的積累具有隨時(shí)間逐漸減少的趨勢(shì)。在暴露2gd后，小鼠肝臟中的40nm-MWNT-COOH團(tuán)聚物基本被清除。脾臟中巨噬細(xì)胞增多說明脾臟也參與了對(duì)兩種MWNT-COOH的吞噬，但從脾臟的病理切片中未能發(fā)現(xiàn)MWNT-COOH團(tuán)聚物的存在。 3.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)靜脈注射的MWNT-COOH在小鼠體內(nèi)會(huì)被富于單核巨噬