電泳中介微分析及其在生化分析中的應(yīng)用.pdf

1、電泳中介微分析技術(shù)(EMMA)是在毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，基于各反應(yīng)物、產(chǎn)物在高壓電場作用下遷移速率不同，在一根毛細(xì)管內(nèi)完成試劑的混合和反應(yīng)，隨后產(chǎn)物和反應(yīng)物在毛細(xì)管內(nèi)被分離為獨(dú)立的區(qū)帶至檢測器被檢測。EMMA既包含了毛細(xì)管電泳(CE)高效分離的特性，也融合了流動(dòng)注射分析(FIA)自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，它的出現(xiàn)為分析化學(xué)的發(fā)展提供了新契機(jī)，也為微流控分析技術(shù)(μ-TAS)提供了一種新思路。EMMA突出優(yōu)點(diǎn)如下：第一，分析物和試劑的混合是在電

2、場作用下的電泳混合，無額外稀釋和區(qū)帶展寬效應(yīng)；第二，混合、反應(yīng)、分離甚至檢測均集成于封閉的毛細(xì)管內(nèi)，不僅提高了分析效率，避免外界污染，而且可用于短壽命反應(yīng)產(chǎn)物的檢測以及快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究；第三，樣品和試劑用量極少，可大大降低分析成本，特別適合于細(xì)胞間液、單細(xì)胞等生化分析；第四，便于自動(dòng)化、小型化，因此可基于此技術(shù)研制床旁(point-of-care)醫(yī)檢儀器等。 因電泳中介微分析具有上述優(yōu)點(diǎn)，自從它誕生以來引起分析工作者的廣泛

3、關(guān)注，現(xiàn)已用于酶(包括酶基體、酶的激動(dòng)劑和抑制劑等)分析、柱內(nèi)衍生、小分子測定等諸多領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)室利用EMMA技術(shù)中的區(qū)帶-區(qū)帶模式了測定了簡單金屬離子Fe2+和Cu2+以及兩種酶，利用連續(xù)模式測定了食品中的氨基酸的并研究了環(huán)糊精與藥物的包合作用等。 本文主要做了以下五個(gè)工作：1、電泳中介微分析法測定鐵(Ⅱ)和銅(Ⅱ)利用電泳中介微分析通過與鄰菲羅啉的絡(luò)合反應(yīng)完成了對(duì)Fe2+和Cu2+的同時(shí)測定。在壓差作用下，淌度較小的鄰菲羅啉

4、在金屬離子區(qū)帶之前首先進(jìn)樣，加高電壓后，兩區(qū)帶電泳在磷酸緩沖液中(pH=4.5)混合、反應(yīng)形成絡(luò)合物并實(shí)現(xiàn)電泳分離。研究了緩沖液pH、試劑和樣品區(qū)帶長度對(duì)分離效果的影響。對(duì)于Fe2+和Cu2+兩離子，方法的檢測限(S/N=3)分別為1.6and11μmol/L，線性范圍分別為5.0×10-6-3.0×10-4mol/L(r=0.9979)和8.0×10-5-3.0×10-4mol/L(r=0.9996)。采用標(biāo)準(zhǔn)礦樣驗(yàn)證了測定Fe2+的

5、可行性。 2、電泳中介微分析法測定超氧化物歧化酶基于超氧化物歧化酶(SOD)對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制作用和電泳中介微分析(EMMA)技術(shù)建立了一種測定SOD的新方法。采用“三明治”式不同pH緩沖液部分填充法，一方面有利于鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)，便于觀察SOD的抑制作用，另一方面則有利于反應(yīng)產(chǎn)物與反應(yīng)物的分離。對(duì)溶液填充模式、反應(yīng)條件等實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明在最優(yōu)條件下，鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的抑制率I與SOD濃度C在1.00×10

6、2-6.00×102μg/L范圍內(nèi)里良好的線性關(guān)系，回歸方程為：I(％)=0.0895C(μg/L)+17.633(r=0.9973)。 3、電泳中介薇分析技術(shù)對(duì)胰凝乳蛋白酶的研究基于胰凝乳蛋白酶對(duì)N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(L-BTEE)的水解作用和電泳中介微分析(EMMA)技術(shù)建立了一種測定胰凝乳蛋白酶的新方法，采用區(qū)帶-區(qū)帶(Plug-plug)模式，對(duì)酶的活性及米氏常數(shù)進(jìn)行了測定，并考察了金屬離子Ca2+(激活劑)和Cu

7、2+、Ni2+(抑制劑)對(duì)酶活性的影響。催化前后產(chǎn)物吸光度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.34％和3.46％。 4、毛細(xì)管電泳間接紫外檢測醬油中的游離氨基酸以三羥甲基氨基甲烷(Tris)(pH=10.50)為緩沖液，苯甲酸為背景電解質(zhì)，利用毛細(xì)管電泳-間接紫外檢測方法分離測定了醬油中的丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸、亮氨酸、谷氨酸及天冬氨酸。在優(yōu)化條件下，上述六種氨基酸于5min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離，各物質(zhì)吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小

8、于5％。線性范圍為10-1000μmol/L，檢測限(S/N=3)分別為2.0，3.5，4.0，5.0，3.5，5.0μmol/L，六種氨基酸的加標(biāo)回收率均在95.9％～104.2％范圍內(nèi)。 5、毛細(xì)管電泳法研究環(huán)糊精與蘆丁和氯霉素的相互作用基于毛細(xì)管電泳淌度移動(dòng)法，同時(shí)測定了β-環(huán)糊精與蘆丁和氯霉素在硼酸緩沖液(pH=8.6)中的包合常數(shù)及包合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)。在優(yōu)化后的測定條件下，25℃時(shí)測得蘆丁和氯霉素與β-CD的包合常數(shù)