我國設(shè)施辣椒中主要鐮刀菌致伏馬毒污染的發(fā)生規(guī)律與產(chǎn)毒分子機理研究.pdf

1、設(shè)施辣椒是我國特種優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品，占膳食消費比重也越來越大。國內(nèi)關(guān)于其真菌毒素污染的相關(guān)基礎(chǔ)研究很少，給食品安全及相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重隱患。伏馬毒素是鐮刀菌次級代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素。伏馬毒素可降低農(nóng)作物的生產(chǎn)性能、損傷動物和人的免疫系統(tǒng)、干擾鞘脂代謝，對人和動物健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。以往研究表明：伏馬毒素對設(shè)施辣椒的污染在國外比較普遍。
　　為了明確我國設(shè)施辣椒中伏馬毒素的污染狀況和發(fā)生規(guī)律，本實驗在全國范圍內(nèi)采集了34個城市的設(shè)施辣椒樣本

2、，通過對其進(jìn)行菌種分離鑒定，確定了我國設(shè)施辣椒的主要致病鐮刀菌種類，進(jìn)而研究不同致病鐮刀菌產(chǎn)伏馬毒素的規(guī)律，最后對茄腐鐮刀菌產(chǎn)伏馬毒素的分子機制進(jìn)行探究。
　　1、從全國34個城市地區(qū)采集了腐爛和健康的設(shè)施辣椒樣本900份，采用組織分離的方法對青椒樣本的發(fā)病部位和健康部位的鐮刀菌進(jìn)行分離和純化，共分離到277株鐮刀菌。運用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對分離到的鐮刀菌進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定主要通過觀察菌落形態(tài)、生長速度、顏色、大小等，并結(jié)

3、合菌絲的形態(tài)和分身孢子的有無及其特點等特征進(jìn)行種屬的鑒定。分子鑒定采用真菌的通用型引物Internal Transscribed(ITS)和鐮刀菌的特異性引物Elongation factor1-α( EF-1α)對菌株的序列擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析。形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定獲得污染我國設(shè)施辣椒的鐮刀菌45株，分屬8個種。得出我國的設(shè)施辣椒上的主要致病鐮刀菌有木賊鐮刀菌（F. equiseti）、多育

4、鐮刀菌（F. proliferatum）、藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）、串珠鐮刀菌（F. verticillioides）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄腐鐮刀菌（F. solani），其中木賊鐮刀菌為優(yōu)勢菌株。實驗結(jié)果表明中國設(shè)施辣椒上的優(yōu)勢菌株與國外的不同，因此在辣椒上伏馬毒素的防控和辣椒爛果病的預(yù)防要與國外的方法有所不同。
　　2、探索時間對不同致病鐮刀菌產(chǎn)伏馬毒素的影響及鐮刀菌在不同生物培養(yǎng)基中的產(chǎn)毒

5、規(guī)律。選取從我國設(shè)施辣椒上分離到的頻次較高的木賊鐮刀菌、多育鐮刀菌、藤倉鐮刀菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌進(jìn)行實驗，將這些代表菌株分別接種到大米培養(yǎng)基中，25℃黑暗培養(yǎng)，分別選取培養(yǎng)7d、14d、21d、28d、35d檢測其伏馬毒素產(chǎn)量。檢測結(jié)果表明：串珠鐮刀菌、藤倉鐮刀菌和多育鐮刀菌在0-28d時，伏馬毒素總產(chǎn)量逐漸升高，28d時達(dá)到最大，在28d-35d時，毒素總含量隨時間的增加而有所減少；尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌在21d時伏

6、馬毒素總量達(dá)到最高，在21d后隨著時間的增加毒素含量逐漸下降。將不同鐮刀菌分別接種到大米培養(yǎng)基和設(shè)施辣椒上，25℃黑暗培養(yǎng)14d，檢測不同培養(yǎng)基伏馬毒素含量。實驗結(jié)果顯示：菌株在大米培養(yǎng)基上的產(chǎn)毒水平高于設(shè)施辣椒；相同鐮刀菌在不同的培養(yǎng)基上和不同時間產(chǎn)伏馬毒素水平存在顯著差異；不同菌株在相同的培養(yǎng)基上產(chǎn)毒水平也不相同。此外，研究還發(fā)現(xiàn)無論在大米培養(yǎng)基上還是設(shè)施辣椒上，茄腐鐮刀菌均能產(chǎn)生伏馬毒素，這一研究還未被報道。
　　3、對茄腐

7、鐮刀菌產(chǎn)伏馬毒素的分子機制進(jìn)行探究。一方面，采用特異性引物FUM1、FUM8、FUM19對茄腐鐮刀菌進(jìn)行PCR擴增，選取高產(chǎn)伏馬毒素的串珠鐮刀菌作為正對照，及不產(chǎn)伏馬毒素的木賊鐮刀菌做負(fù)對照。另一方面，對該茄腐鐮刀菌進(jìn)行基因組高通量測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行分析。實驗結(jié)果如下：由于茄腐鐮刀菌電泳無特異性條帶出現(xiàn)，表明該鐮刀菌中并不含有 FUM1、FUM8、FUM19序列，通過對基因組高通量重測序結(jié)果分析，得出該菌株體內(nèi)無FUM基因存在，但通