外二醇雙加氧酶BphC的固定化及其強化聯(lián)苯降解特性.pdf

1、芳烴化合物在工業(yè)生產(chǎn)過程中得到廣泛應(yīng)用，但其在環(huán)境中不易被降解，會不斷積累而造成長期污染。在研究中發(fā)現(xiàn)，微生物降解是去除芳烴化合物的主要途徑。其中開環(huán)斷裂過程是微生物降解芳烴化合物過程中的關(guān)鍵步驟，而外二醇雙加氧酶是作用于這一過程的重要酶類。本論文對實驗室分離得到的聯(lián)苯降解菌株Dyella sp.LA-4進(jìn)行了全基因組測序和分析，確定了唯一的聯(lián)苯代謝基因簇。隨后，分別利用磁性納米顆粒Fe3O4以及介孔分子篩SBA-15固定化代謝途徑中的

2、限速酶外二醇雙加氧酶BphC，考察固定化BphC的酶學(xué)特性，并將固定化酶應(yīng)用于菌株Dyella sp.LA-4降解聯(lián)苯的反應(yīng)體系中，為推進(jìn)該酶在實際的生物修復(fù)過程中的應(yīng)用提供重要的借鑒。
　　采用Illumina測序方法得到了菌株LA-4的全基因組序列，是目前唯一一株聯(lián)苯降解菌株的全基因組報道。經(jīng)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其存在唯一的聯(lián)苯降解基因簇bphA1A2(orf1)A3A4BCX0。根據(jù)前期的實驗結(jié)果，選擇了整條途徑中的限速酶—

3、—2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶(BphC)進(jìn)行同源模建，得到可靠的BphC三級結(jié)構(gòu)模型。
　　考察了磁性材料Fe3O4負(fù)載BphC的固定化條件以及催化特性。其固定最優(yōu)條件為:pH9.0，F(xiàn)e3O4超聲時間10～30 min，共孵化時間30 min。利用紅外光譜(FTIR)分析，證明BphC被成功固定于Fe3O4上。在該條件下得到的固定化酶BphC-Fe3O4，負(fù)載量為40.70 mg/g，保留活性42.3％，且其穩(wěn)定性相比游

4、離酶有明顯提高。
　　為了進(jìn)一步提高BphC固定化酶的固定量和穩(wěn)定性，利用介孔分子篩SBA-15對BphC進(jìn)行固定化。利用蛋白滴定曲線與不同pH下的BphC表面電荷分布分析，預(yù)測固定化的最優(yōu)pH為8.0，并通過實驗得以證實。利用FTIR以及N2吸附/脫附曲線等表征手段，證明BphC被成功固定。得到的固定化酶BphC-SBA-15的蛋白負(fù)載量為124.58mg/g，保留活性為38％，其儲藏穩(wěn)定性從12h增長至5d。利用圓二色譜技術(shù)，

5、證明固定于SBA-15的BphC的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，推測是酶活性及穩(wěn)定性變化的關(guān)鍵因素。
　　同時，為了考察固定化酶的實際應(yīng)用價值，將兩種固定化酶投加到菌株LA-4降解聯(lián)苯的反應(yīng)體系中，發(fā)現(xiàn)BphC-Fe3O4可加速2-羥基-6-氧-6-苯基己二烯酸(HOPDA)的生成，生成時間較空白樣品縮短了32 h，而BphC-SBA-15沒有明顯表現(xiàn)出對聯(lián)苯降解的強化作用。該結(jié)果初步證明了固定化酶強化聯(lián)苯生物降解體系具有可行性，但強化的性能