天然無內(nèi)含子mRNA轉(zhuǎn)運出核順式作用元件的預測與功能鑒定.pdf

1、背景：mRNA轉(zhuǎn)運出核一直是RNA領域的研究熱點與難點，近些年的研究中發(fā)現(xiàn)mRNA中存在調(diào)控其轉(zhuǎn)運出核的順式作用元件[1]。在高等生物中，出核轉(zhuǎn)運與剪接過程是關聯(lián)十分密切的。在mRNA發(fā)生剪接過程時，剪接復合體會直接招募出核轉(zhuǎn)運復合體并共同完成剪接與出核兩種生命活動[2-5]。刪除基因的內(nèi)含子后，mRNA會因為剪接事件的終止而被阻滯在細胞核內(nèi)[6]。所以在剪接與轉(zhuǎn)運出核相偶聯(lián)的mRNA中，內(nèi)含子就成為轉(zhuǎn)運出核的順式作用元件[7]。天然無

2、內(nèi)含子mRNA占全部mRNA的5%，其中包含著像干擾素、組蛋白等對生物體的生命過程非常重要的基因[8]。天然無內(nèi)含子mRNA其本身因不具有內(nèi)含子而不會發(fā)生剪接過程，那么這些天然無內(nèi)含子的mRNA是否同樣存在轉(zhuǎn)運出核的順式作用元件呢？本實驗室在之前對4個天然無內(nèi)含子mRNA（HSPB3、IFNα1、IFNβ1,、c-Jun）的研究中，發(fā)現(xiàn)4條mRNA中的保守序列CAR-E（促細胞質(zhì)區(qū)域聚集元件）能夠促進已阻滯在細胞核內(nèi)的β-球蛋白cDNA

3、轉(zhuǎn)運出核[9]。那么在更大范圍的天然無內(nèi)含子mRNA中是否同樣存在這樣功能的順式作用元件？這些順式作用元件的結合蛋白是什么？目前的研究依然沒有解決這些問題。本文通過對天然無內(nèi)含子mRNA轉(zhuǎn)運出核機制的研究完善mRNA轉(zhuǎn)運出核機制。
　　方法：1.通過生物信息學比對軟件MEME對天然無內(nèi)含子的mRNA數(shù)據(jù)庫（Intronless Gene Database）進行比對，檢索其中存在的共有片段。2.將獲取的共有片段與已驗證阻滯在細胞核內(nèi)

4、的β-球蛋白的cDNA進行重組連接，通過原位熒光雜交技術（FISH）尋找可以促進cDNA發(fā)生出核轉(zhuǎn)運的片段。3.通過生物信息學軟件FIMO對天然無內(nèi)含子mRNA數(shù)據(jù)庫進行反檢索，找到含有促進cDNA出核序列的天然無內(nèi)含子mRNA，并對其中預測的順式作用元件進行堿基刪除、突變，檢測其在天然無內(nèi)含子mRNA中是否具有促進出核的功能。4.構建預測元件、β-球蛋白cDNA與pCDNA5載體的重組質(zhì)粒。利用Flp-In系統(tǒng)在FRT-Hela細胞中

5、構建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。并通過MS2-MBP蛋白純化體系與質(zhì)譜分析方法確定順式作用元件的結合蛋白[10]。
　　結果：通過生物信息學軟件MEME將679個天然無內(nèi)含子mRNA數(shù)據(jù)進行比對，發(fā)現(xiàn)其中含有多條共有序列。FISH實驗結果顯示在預測的順式作用元件中有4條能夠促進β-球蛋白cDNA的mRNA出核轉(zhuǎn)運，我們分別命名為motif1-AS、motif1V-AS、motif4-AS、motif5。天然無內(nèi)含子mRNA KRN1基因中含有9個

6、預測元件motif1V-AS，其中6個元件位置相近我們將這6個元件整體命名為CAR-C。通過分子克隆的方法將CAR-C進行刪除與突變，F(xiàn)ISH實驗結果顯示刪除與突變后的KRN1 mRNA會被阻滯在細胞核內(nèi)。完成穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞構建后我們通過MS2-MBP蛋白結合體系，得到預測元件的結合蛋白，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后的銀染實驗發(fā)現(xiàn)促出核元件結合蛋白與非促出核元件結合蛋白存在特異性條帶。
　　結論：實驗數(shù)據(jù)表明預測中具有促進β-