一種蛋白內(nèi)含子介導(dǎo)純化的原核表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)剪切是一種翻譯后修飾事件,它將插入前體蛋白的中間的蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)剪切出來,并用正常肽鍵將兩側(cè)蛋白質(zhì)多肽鏈連接起來.在此過程中不需要輔酶或輔助因子的作用,僅需四步分子內(nèi)反應(yīng).Intein及其側(cè)翼序列可以通過突變產(chǎn)生高度特異性的自我切割用于蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)連接和蛋白質(zhì)環(huán)化反應(yīng),在蛋白質(zhì)工程方面有廣泛的應(yīng)用前景.pTWIN載體在intein的N末端融合有chitin binding domain(CBD),它可使inte

2、in融合蛋白吸附于幾丁質(zhì)珠上.當將單鏈抗體(PG)融合到intein的C末端表達時,在pH值為7,溫度為25℃的條件下,intein被誘導(dǎo)在其和目的蛋白之間進行自切割.這樣,目的蛋白就被釋放出來.基于intein自切割的蛋白純化系統(tǒng)屬于一次性純化系統(tǒng),該系統(tǒng)無需使用蛋白酶,避免了蛋白酶切割所帶來的非特異性酶解,也無需進一步純化去除蛋白酶,是一個省時經(jīng)濟的好方法.基因工程抗體在大腸桿菌中大量表達時,產(chǎn)物往往聚集成不溶的形式,即包涵體.這主

3、要是因為基因工程抗體是在天然抗體分子的基礎(chǔ)上構(gòu)建的人工分子,其折疊成熟依賴于大腸桿菌的折疊酶和分子伴侶類蛋白,而組成型表達的輔助折疊分子不足以完成促進新生蛋白折疊的功能,所以在大腸桿菌中表達時容易形成不可溶的產(chǎn)物.由脯氨酸殘基連接的肽鍵有順式和反式兩種,在天然蛋白質(zhì)中,該肽鍵為反式結(jié)構(gòu).蛋白質(zhì)在折疊過程中,需要將順式異構(gòu)化為反式,這也是蛋白折疊中的一個限速步驟,由肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶來催化.一般認為,大腸桿菌肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶在蛋白折

4、疊起始中起重要作用,被稱為Trigger Factor.FkpA屬于大腸桿菌FKBP家族蛋白,是周質(zhì)腔肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶的一種.它有兩種功能,有順反異構(gòu)和分子伴侶功能,確切的講,FkpA能與早期折疊中間體結(jié)合并阻止它的聚合,因此能有效地促進目的蛋白的可溶表達.為提高可溶蛋白的比例,該研究在已構(gòu)建的單鏈抗體pTWIN表達載體的基礎(chǔ)上,引入FkpA,使其與單鏈抗體融合及共表達.結(jié)果顯示PG融合蛋白對幾丁質(zhì)柱的吸附效率很高,intein的自