簡介：細胞生物學細胞生物學理論課教學大綱理論課教學大綱課程代碼課程代碼10271014課程名稱課程名稱細胞生物學課程英文名稱課程英文名稱CELLBIOLOGY課程類別課程類別學科基礎課程課程性質課程性質必修課授課對象授課對象醫(yī)學試驗班（七年制）開課學期開課學期第5學期學時數(shù)學時數(shù)60（理論學時∕實驗學時32∕28）學分學分3選用教材選用教材細胞生物學楊恬主編人民衛(wèi)生出版社2005年主要參考書主要參考書1MOLECULARCELLBIOLOGY5THEDITIONDARNELLJADDISONWESLEYPUBLCO20042ESSENTIALCELLBIOLOGY2NDEDITIONALBERTSBGARLPUBLISHING，INC20043CELLMOLECULARBIOLOGY3RDEDITIONGERALDKARPPUBLISHEDBYJOHNWILEYSONSINC20024醫(yī)學細胞生物學湯雪明主編科學出版社2003年5醫(yī)學細胞分子生物學宋今丹主編人民衛(wèi)生出版社2003年6分子細胞生物學韓貽仁主編科學出版社2002年7細胞生物學汪堃仁主編北京師范大學出版社2003年編寫單位編寫單位細胞生物學系執(zhí)筆人執(zhí)筆人劉睿智鄭賢紅編寫日期編寫日期2009年6月一、課程教學目標一、課程教學目標細胞生物學是一門新興的邊緣學科，其內容是研究細胞結構、功能以及各種生命現(xiàn)象的一門新興學科，是現(xiàn)代醫(yī)學的重要基礎性學科，與臨床醫(yī)學有密切聯(lián)系，決定了它在醫(yī)學領域的地位及今后的發(fā)展方向。因此，在醫(yī)學院校開設細胞生物學，不僅使學生了解現(xiàn)代細胞生物學的基本內容，掌握細胞生物學的基礎知識，而且還為臨床醫(yī)學基礎課打下良好基礎。二、教學基本要求二、教學基本要求1、授課方式、授課方式4細胞外基質及其與細胞的相互作用25細胞的內膜系統(tǒng)36線粒體與細胞的能量轉換17細胞骨架與細胞的運動28細胞核49細胞的信號轉導210細胞分裂與細胞周期411細胞分化412細胞衰老與細胞死亡213干細胞2合計32第一章第一章緒論（論（1學時）學時）【目的與要求目的與要求】1掌握細胞、細胞生物學的概念。2了解細胞生物學的研究內容及當前細胞生物學研究的總趨勢與重點領域；了解細胞生物學的發(fā)展簡史、與醫(yī)學的關系及研究進展?！窘虒W內容教學內容】1細胞生物學的研究內容。2細胞生物學的發(fā)展簡史。3細胞生物學的研究進展。4細胞生物學與醫(yī)學科學。

簡介：高中生物學教材涉及到的免疫細胞來源和作用的例解EDITEDBYMARTZEPINGOCTOBER120081免疫細胞的來源免疫細胞的來源造血干細胞造血干細胞免疫細胞一般分為淋巴細胞和吞噬細胞，它們都來自造血干細胞，造血干細胞是存在于造血組織中的一群原始造血細胞，一般分為3級，即多能干細胞、定向干細胞及其成熟的子代細胞。其中多能干細胞進一步分化為淋巴系干細胞、髓系多能干細胞。11淋巴細胞的產生及發(fā)育淋巴系干細胞進入胸腺在胸腺內發(fā)育T細胞淋巴系干細胞進入骨髓在骨髓內發(fā)育B細胞111T細胞的產生及發(fā)育112B細胞的產生及發(fā)育例類別功能中性粒細胞吞噬作用嗜酸性粒細胞破壞抗原抗體復合體，參與脫敏反應粒細胞嗜堿性粒細胞釋放組織胺和抗炎癥因子淋巴細胞特異免疫中起作用白細胞無粒細胞單核細胞巨噬作用3高中教材中與免疫有關的細胞比較表高中教材中與免疫有關的細胞比較表免疫細胞來源功能吞噬細胞造血干細胞處理呈遞抗原，吞噬抗原抗體復合體B細胞在骨髓發(fā)育的造血干細胞識別抗原，分化為漿細胞和記憶細胞漿細胞B細胞或記憶細胞分泌抗體T細胞在胸腺中發(fā)育的造血干細胞識別呈遞抗原，分化為效應T細胞和記憶細胞效應T細胞T細胞或記憶細胞與靶細胞結合發(fā)揮免疫效應，分泌淋巴因子記憶細胞B細胞或T細胞識別抗原，分化為相應的效應細胞，發(fā)揮免疫效應4拓展提升拓展提升1）T細胞接受吞噬細胞處理過的抗原而增殖分化為效應T細胞。2）B細胞接受T細胞轉運的抗原或直接受抗原刺激分化為漿細胞。3）在免疫反應中能識別抗原的細胞有、、、、。（吞噬細胞、T細胞、B細胞、效應T細胞、記憶細胞）4）受抗原刺激后的淋巴細胞（2004年廣西、廣東高考題）A細胞周期變長，核糖體活動增強B細胞周期變長，核糖體活動減弱C細胞周期變短，核糖體活動減弱D細胞周期變短，核糖體活動增強5）下列細胞不可能在淋巴液中出現(xiàn)的是A漿細胞BT細胞C紅細胞D吞噬細胞6）產生抗體的細胞是A吞噬細胞B靶細胞CT細胞D漿細胞7）在特異性免疫中發(fā)揮作用的主要細胞是A紅細胞B吞噬細胞C淋巴細胞D血小板

簡介：802細胞與分子生物學考試大綱（2014版）細胞生物學部分胞生物學部分1細胞生物學的研究內容細胞生物學的主要研究內容，細胞學說的創(chuàng)立及其內容要點和意義，當前細胞生物學研究的總趨勢與重點領域。2細胞的統(tǒng)一性與多樣性細胞的基本概念、原核細胞與古核細胞、真核細胞以及非細胞生命體的基本知識概要。3細胞生物學的研究方法細胞形態(tài)結構的觀察方法和相關儀器的原理和應用范圍，細胞化學組成及其定位和動態(tài)分析技術的原理和應用范圍，動物細胞培養(yǎng)的相關概念和原理，用于細胞生物學研究的模式生物。4細胞質膜生物膜結構模型的基本要點，生物膜的基本組成成分及其特點和意義，生物膜的基本特征與功能，膜骨架的結構特點和研究方法。5物質的跨膜運輸物質的跨膜運輸?shù)幕靖拍?、主要方式、運輸?shù)幕具^程。6細胞的能量轉換線粒體的顯微形態(tài)特征和主要功能，超微結構與功能定位及各部的結構和化學的組成特點，內膜進行能量轉化氧化磷酸化的分子和超分子結構基礎與轉化機制，線粒體的半自性，線粒體的增殖和起源。7細胞內膜系統(tǒng)細胞質基質的不同概念和功能。內膜系統(tǒng)的概念及其組成成員，內質網(wǎng)、高爾基復合體的形態(tài)結構、標志性酶以及功能。溶酶體與過氧化物酶體的結構特點，功能。信號假說與蛋白質分選信號。蛋白質分選的基本途徑與類型。膜泡運輸。8細胞信號轉導細胞通訊與細胞識別的基本知識和基本概念，信號傳遞的類型及其作用機制包括胞內受體介導的信號通路及信號分子和膜受體介導的信號通路及信號分子Ｇ蛋白偶聯(lián)的CAMP特性，細胞凋亡的分子機制，植物細胞的凋亡，細胞凋亡與衰老。14細胞分化與基因表達調控細胞分化的基本概念、干細胞的基本概念和相關知識、癌細胞的基本特征及腫瘤的發(fā)生等。15細胞社會的聯(lián)系細胞連接、細胞黏著和細胞外基質，細胞連接的方式、特點及生物學意義，細胞黏著的分子基礎，細胞外基質的基本概念、組成、化學結構特點和功能。分子生物學部分分子生物學部分分子生物學要求掌握DNA的結構、DNA的復制、DNA的轉錄、蛋白質的翻譯、原核生物的基因表達調控和真核生物的基因表達調控等的基本概念和基本理論，具體包括以下七個部分。1分子生物學的定義和研究內容要求分子生物學的定義、分子生物學研究的主要內容、分子生物學的發(fā)展歷程和當今分子生物學發(fā)展的趨勢。重點是理解并掌握分子生物學發(fā)展歷程中重要發(fā)現(xiàn)及其理論意義。2染色體、DNA和基因要求掌握經典遺傳學、染色體、DNA和基因等的基礎知識，具體包括DNA的高級結構，理解基因的內涵以及染色體、DNA和基因三者之間的關系，掌握遺傳學的三大定律、DNA的一級和二級結構、DNA的變性、復性和雜交等基本理論。3DNA的復制要求掌握DNA復制的基本特點、復制過程、復制調控和DNA修復等的基礎知識，具體包括DNA復制的主要方式，真核生物DNA的復制特點和DNA復制的調控，DNA的半保留復制，DNA的半不連續(xù)復制等的基本特征，原核生物DNA的復制過程和DNA的修復的基礎知識。4生物信息的傳遞（上）從DNA到RNA要求掌握轉錄的基本過程、與轉錄相關的酶學和蛋白質、啟動子的結構特征、生物MRNA的特征以及終止和抗終止等的基礎知識，具體包括轉錄的基本過程，轉錄過程中終止和抗終止，I類和Ⅱ類內含子的自我拼接等內容，原核和真核生物啟動子的結構特征、內含子與外顯子的內涵等基本理論，原核和真核生物啟動子的結構特征，與轉錄相關的酶學和蛋

簡介：第四節(jié)第四節(jié)單細胞生物單細胞生物【學習目標學習目標】1、理解單細胞生物是依靠一個細胞完成生命活動的。2、通過對單細胞生物生命活動的觀察，認同細胞構成生物體的觀點；3、了解單細胞生物和我們人類的關系，培養(yǎng)珍惜生命，愛護生命的情感。【重點和難點重點和難點】重點觀察草履蟲的生命活動、了解草履蟲運動、呼吸、消化等生理功能。難點利用事實說明對于單細胞生物來說，一個細胞就是一個完整獨立的生物體。【學習過程學習過程】一、課前自主學習（閱讀教材一、課前自主學習（閱讀教材P6568完成練習）完成練習）1、生物圈中有不少肉眼很難看見的生物，它們的身體只有，稱為生物。如、、等2、草履蟲的整個身體就是一個，草履蟲依靠進行運動，食物從進入細胞內，在內進行消化，不能消化的食物殘渣從排出。通過和把體內多余的水分和廢物收集起來，排出體外。（2）草履蟲是動物還是植物學習任務四學習任務四4、閱讀P68單細胞生物與人類的關系總結單細胞生物與人類存在哪些關系三、診斷評價三、診斷評價1下列生物中屬于單細胞生物的是A變形蟲B大豆C螞蟻D蚯蚓2顯微鏡觀察草履蟲時，經常在臨時裝片的培養(yǎng)液中放一些棉絲，其作用是（）A限制草履蟲運動B增加營養(yǎng)C便于計數(shù)D增加溫度3草履蟲的表膜不具有的功能是A保護B吸收氧氣C排出二氧化碳D消化4用顯微鏡觀察草履蟲時，看到蟲體內的食物泡是A大小相等，數(shù)量兩個B大小相等，數(shù)量多個C大小不等，數(shù)量兩個D大小不等數(shù)量多個5右圖是草履蟲結構示意圖，請據(jù)圖回答下列問題（1）顯微鏡下草履蟲的形狀像一只_____________。（2）圖中的結構____________具有運動作用，具有呼吸作

簡介：細胞生物學細胞生物學理論教學大綱理論教學大綱課程代碼課程代碼10271016課程名稱課程名稱細胞生物學課程英文名稱課程英文名稱CELLBIOLOGY課程類別課程類別學科基礎課程課程性質課程性質必修課授課對象授課對象藥學開設學期開設學期第5學期學時數(shù)學時數(shù)40（理論學時40）學分數(shù)學分數(shù)25選用教材選用教材醫(yī)學細胞生物學陳譽華主編人民衛(wèi)生出版社2008年主要參考書主要參考書1MOLECULARCELLBIOLOGY5THEDITIONDARNELLJADDISONWESLEYPUBLCO20042ESSENTIALCELLBIOLOGY2NDEDITIONALBERTSBGARLPUBLISHING，INC20043CELLMOLECULARBIOLOGY3RDEDITIONGERALDKARPPUBLISHEDBYJOHNWILEYSONSINC20024醫(yī)學細胞生物學湯雪明主編科學出版社2003年5醫(yī)學細胞分子生物學宋今丹主編人民衛(wèi)生出版社2003年6分子細胞生物學韓貽仁主編科學出版社2002年7細胞生物學汪堃仁主編北京師范大學出版社2003年8醫(yī)學細胞生物學（第三版）宋今丹主編人民衛(wèi)生出版社2004年編寫單位編寫單位細胞生物學系執(zhí)筆人執(zhí)筆人劉睿智鄭賢紅編寫日期編寫日期2009年6月一、課程教學目標一、課程教學目標細胞生物學是一門新興的邊緣學科，其內容是研究細胞結構、功能以及各種生命現(xiàn)象的一門新興學科，是現(xiàn)代醫(yī)學的重要基礎性學科，與臨床醫(yī)學有密切聯(lián)系，決定了它在醫(yī)學領域的地位及今后的發(fā)展方向。因此，在醫(yī)學院校開設細胞生物學，不僅使學生了解現(xiàn)代細胞生物學的基本內容，掌握細胞生物學的基礎知識，而且還為臨床醫(yī)學基礎課打下良好基礎。二、教學基本要求二、教學基本要求5細胞骨架與細胞的運動26細胞核47細胞連接與細胞粘連28細胞外基質及其與細胞的相互作用29細胞的信號轉導410細胞分裂與細胞周期411細胞分化412細胞衰老與細胞死亡413干細胞2合計40第一章第一章緒論（論（1學時）學時）【目的與要求目的與要求】1掌握細胞、細胞生物學的概念。2了解細胞生物學的研究內容及當前細胞生物學研究的總趨勢與重點領域；了解細胞生物學的發(fā)展簡史?！窘虒W內容教學內容】1細胞生物學。2細胞生物學是醫(yī)學的重要基礎。3細胞生物學發(fā)展經歷的幾個主要階段。【重點與難點重點與難點】重點重點細胞生物學的概念。難點難點細胞生物學的研究內容及當前細胞生物學研究的總趨勢與重點領域。第二章第二章細胞的概念與分子基礎（自學）細胞的概念與分子基礎（自學）【目的與要求目的與要求】1掌握原核細胞與真核細胞的異同。2了解細胞進化的一般規(guī)律。【自學內容自學內容】

簡介：細胞生物學專業(yè)碩博連讀研究生培養(yǎng)方案一、培養(yǎng)目標本專業(yè)培養(yǎng)德、智、體全面發(fā)展的細胞生物學與相關學科的高級專門人才。要求學生具有堅定正確的政治方向，熱愛祖國，具有良好的科學道德與嚴謹學風，遵紀守法，具有團結合作、勇于追求真理和獻身于科學研究及教育事業(yè)的精神；掌握堅實寬厚的細胞生物學基礎理論和系統(tǒng)深入的專業(yè)知識，熟悉本學科的發(fā)展趨勢，了解本學科相關領域的前沿動態(tài)，熟練地掌握科學研究的基本技能和方法，具有較強的獨立從事科學研究的能力，在有關領域中做出創(chuàng)造性的成果；能熟練地運用至少一門外國語；具有健康的心理素質和體魄。二、研究方向信號傳導；細胞免疫；腫瘤生物學治療；細胞凋亡；細胞周期；細胞分子生物學；細胞結構與功能；細胞工程（生物技術和細胞培養(yǎng)）。三、學習年限按中山大學學位與研究生教育工作手冊及中山大學文件中大研院（2003）3號“中山大學碩博連讀研究生培養(yǎng)工作試行辦法的規(guī)定執(zhí)行。碩士學制三年。四、課程設置類別編號課程名稱開課學期學時學分任課教師職稱考核方式0000002101第一外國語FIRSTFEIGNLANGUAGE11205外語學院考試公共課0000002103馬克思主義理論THEYOFMARXISM1，2724教育學院考試0710092101細胞分子生物學（二）MOLECULARBIOLOGYOFTHECELL1603歐陽學智教授考試基礎課0710102102生化與分子生物學研究技術METHODSINBIOCHEMISTRYMOLECULARBIOLOGY3804屈良鵠教授考試0710091102細胞生物學專題TOPICSOFCELLBIOLOGY23804各導師考試0710102103細胞分子生物學研究技術METHODSINMOLECULARBIOLOGYOFTHECELL3804歐陽學智教授考試必修課專業(yè)課3300002101生命科學進展ADVANCEINLIFESCIENCE12804徐安龍教授等考試選修課公共課0000002210第二外國語SECONDFEIGNLANGUAGE3802外語學院考試0710102212分子生物學文獻LITERATURESINMOLECULARBIOLOGY1603張尚宏副教授考試0710102222生化與分子生物學儀器分析PRINCIPLEAPPLICATIONOFINSTRUMENTSINBIOCHEMISTRYMOLECULARBIOLOGY1603周惠教授考試0710092215高級細胞生物學實驗ADVANCEDEXPERIMENTINCELLBIOLOGY1，2804各導師安排考試0710102227基因工程與分子生物學實驗EXPERIMENTSINGENEENGINEERINGMOLECULARBIOLOGY1，2804周惠教授考試0710211102基因組學與生物信息學GENOMICSBIOINFMATICS2804徐安龍教授等考試0710092219胚胎發(fā)育與干細胞生物學DEVELOPMENTALBIOLOGYOFEMBRYOSTEMCELL1603劉林教授呂祁峰考試0710092220小鼠胚胎實驗操作技術MANIPULATINGTHEMOUSEEMBRYO2603劉林教授呂祁峰考試0710092221MAPK蛋白激酶信號傳導通路的研究方法RESEARCHMETHODSINMITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEMAPKSIGNALINGPATHWAY24603李迎秋教授考試0710092222T淋巴細胞活化的研究進展PROGRESSINRESEARCHOFTCELLACTIVATION23402李迎秋教授考試講座0710092221細胞與分子生物學前沿講座SEMINAROFCELLMOLECULARBIOLOGY14402導師組考查0710101204教學實踐TEACHINGPRACTICE402導師組考查實踐課五、考核按中山大學學位與研究生教育工作手冊及中山大學文件中大研院（2003）3號“中山大學碩博連讀研究生培養(yǎng)工作試行辦法的規(guī)定執(zhí)行。六、學位論文的工作及發(fā)表論文的要求按中山大學學位與研究生教育工作手冊及中山大學文件中大研院（2003）3號

簡介：1細胞生物學講義課程學習1細胞概述目錄1細胞概述11細胞的發(fā)現(xiàn)及細胞學說的創(chuàng)立111細胞的發(fā)現(xiàn)112細胞學說CELLTHEY的創(chuàng)立113細胞學理論對細胞學發(fā)展的推動作用114細胞生物學發(fā)展簡史12細胞的基本功能和特性121細胞的基本功能122細胞結構上的相似性123細胞的形態(tài)124細胞的大小及體積的恒定125細胞及細胞器的計量單位13細胞的分子基礎131水是細胞中最主要的物質132無機鹽133小分子有機小分子134生物分子的功能分類135細胞結構體系的組裝14細胞的類型和結構體系141原核細胞142真核細胞的兩種主要類型動物細胞和植物細胞143真核細胞的結構體系144真核細胞與原核細胞的比較15病毒非細胞的生命體151病毒是比細胞更小的生命體152病毒的生活史16細胞生命的進化161細胞生命的起源與進化162真核細胞的起源163從單細胞向多細胞進化17我國細胞生物學的發(fā)展戰(zhàn)略171細胞生物學的主要研究內容和發(fā)展方向172我國細胞生物學發(fā)展戰(zhàn)略學習指導課程學習1細胞概述111細胞的發(fā)現(xiàn)1細胞概述所有的生物都是由細胞CELL構成的。除了病毒、類病毒等是非細胞的生命體以外，其它生命有機體的結構和功能單位都是細胞。細菌、酵母等微生物是以單細胞的形式存在，而高等動、植物則是由多細胞構成的，如人大約有31013個細胞，這些細胞組成不同的組織和器官。研究細胞及其生物學功能的科學稱為細胞生物學CELLBIOLOGY。11細胞的發(fā)現(xiàn)及細胞學說的創(chuàng)立第一個發(fā)現(xiàn)細胞的是英國學者胡克RBERTHOOKE，相隔170多年后，德國植物學家施來登MATHIASSCHLEIDEN和動物學家施旺THEODSCHWANN創(chuàng)立了細胞學說。111細胞的發(fā)現(xiàn)細胞的發(fā)現(xiàn)得益于光學顯微鏡的研制和發(fā)展。第一臺顯微鏡是荷蘭眼鏡商詹森HANSJANSSEN在1604年發(fā)明的。■1665年，英國的物理學家胡克用自己設計并制造的顯微鏡觀察櫟樹軟木塞切片時發(fā)現(xiàn)其中有許多小室，狀如蜂窩，稱為“CELLA“，這是人類第一次發(fā)現(xiàn)細胞，不過，胡克發(fā)現(xiàn)的只是死的細胞壁圖11。胡克的發(fā)現(xiàn)對細胞學的建立和發(fā)展具有開創(chuàng)性的意義，其后，生物學家就用“CELL“一詞來描述生物體的基本結構?！?674年，荷蘭布商列文虎克ANTONVANLEEUWENHOEK為了檢查布的質量，親自磨制透鏡，裝配了高倍顯微鏡300倍左右，并觀察到了血細胞、池塘水滴中的原生動物、人類和哺乳類動物的精子，這是人類第一次觀察到完整的活細胞。列文虎克把他的觀察結果寫信報告給了英國皇家學會，得到英國皇家學會的充分肯定，并很快成為世界知名人士。胡克和列文虎克發(fā)現(xiàn)細胞的動機是不同的，你對此有何感想圖11胡克所用的顯微鏡及觀察的櫟樹細胞壁課程學習1細胞概述112細胞學說CELLTHEY的創(chuàng)立112細胞學說CELLTHEY的創(chuàng)立■1838年，德國植物學家施來登MATHIASSCHLEIDEN提出盡管植物的不同組織在結構上有著很大的差異，但是植物是由細胞構成的，植物的胚是由單個細胞產生的?！?839年，德國動物學家施旺THEODSCHWANN提出了細胞學說的兩條最重要的基本原理∶①地球上的生物都是由細胞構成的②所有的生活細胞在結構上都是類似的。■1855年，德國醫(yī)生和病理學家魏爾肖RUDOLFVIRCHOW補充了細胞學說的第三條原理所有的細胞都是來自于已有細胞的分裂，即細胞來自于細胞。細胞學說的創(chuàng)立大大推進了人類對生命自然界的認識，有力地促進了生命科學的進步。恩格斯對細胞學說給予極高的評價，把它與進化論和能量守恒定律并列為19世紀的三大發(fā)明。為什么恩格斯對細胞學說給予與此高的評價課程學習1細胞概述113細胞學理論對細胞學發(fā)展的推動作用113細胞學理論對細胞學發(fā)展的推動作用細胞科學是實驗科學，而實驗科學的發(fā)展既依賴于實3主要載體。為了保證遺傳信息的準確傳遞，RNA被保留下來，專司遺傳信息的轉錄和指導蛋白質的合成。所以，無論是原核生物還是真核生物都具有DNA和RNA。不過，少數(shù)原始生命形式的病毒，仍然保留RNA作為遺傳信息的載體?！黾毎季哂泻颂求w所有類型的細胞，包括最簡單的支原體都含有核糖體。真核細胞和原核細胞的核糖體不僅功能相同，在結構上也十分相似，都是由大小兩個亞基組成的，只不過原核細胞的核糖體比真核細胞的核糖體稍小一些。課程學習1細胞概述123細胞的形態(tài)123細胞的形態(tài)細胞具有多種多樣的形態(tài)圖12，有球形、桿狀、星形、多角形、梭形、圓柱形等。多細胞生物體，依照細胞在各種組織和器官中所承擔的不同功能，分化形成了各種不同的形狀。這些不同的形狀一方面取決于對功能的適應，另一方面亦受細胞的表面張力、胞質的粘滯性、細胞膜的堅韌程度，以及微管和微絲骨架等因素的影響。圖12不同的細胞形態(tài)舉例說明細胞的形態(tài)與功能是相關的。課程學習1細胞概述124細胞的大小及體積的恒定124細胞的大小及體積的恒定細胞最為典型的特點是在一個極小的體積中形成極為復雜而又高度組織化的結構。典型的原核細胞的平均大小在1～10ΜM之間，而真核細胞的直徑平均為3～30ΜM，一般為10～20ΜM圖13。圖13典型的原核、真核、病毒和分子的大小■細胞體積的守恒定律不同細胞的大小變化很大，如人的卵細胞的直徑只有01MM，而鴕鳥的卵細胞的直徑則有5CM。但是，同類型細胞的體積一般是相近的，不依生物個體的大小而增大或縮小。如人、牛、馬、鼠、象的腎細胞、肝細胞的大小基本相同。因此，器官的大小主要決定于細胞的數(shù)量，與細胞的數(shù)量成正比，而與細胞的大小無關，把這種現(xiàn)象稱之為“細胞體積的守恒定律“。■限制細胞體積大小的因素●體積同表面積的關系以球形細胞為例體內的細胞并非都是球形，計算體積同表面積的關系圖14。結果表明，球形細胞增大，其體積增加的比例要比表面積增加得多。這樣，當細胞增大到一定程度時，質膜的表面積就不適應細胞進行內外物質的交換，細胞為了維持一個最佳的生存條件，必需維持最佳的表面積，從而限制了體積的無限增大。圖14細胞體積與表面積間的關系●細胞內關鍵分子的濃度一些重要的分子在細胞內的拷貝數(shù)是很少的，當細胞體積增大時，這些分子的濃度就越來越稀釋，一些重要的生化反應需要一定的濃度才能進行，所以細胞內分子濃度就成了限制細胞體積無限增大的另一個因素。真核細胞的體積一般是原核細胞的1000倍，真核細胞如何解決細胞內重要分子的濃度問題●酶蛋白質種類的限制細胞不僅對體積的增大有限制，而且對體積的減少也有限制。一個生活細胞要維持正常的獨立生活功能，最低限度需要500～1000種不同類型的酶和蛋白質，這是目前在支原體MYCOPLASMA中所發(fā)現(xiàn)的酶和蛋白質的量。而支原體是目前所知最小原核細胞，很顯然，細胞體積最小化受制于維持細胞生命活動所需的酶和蛋白質種類的最低限度。課程學習1細胞概述125細胞及細胞器的計量單位125細胞及細胞器的計量單位有兩種計量細胞大小的單位，微米ΜM和納米NM。1ΜM等于106M，1NM等于109M。使用電子顯微鏡后又提出埃ANGSTROM，為超顯微結構的計量單位，1埃01納米，但并不常用。較大的細胞器通常用ΜM表示，如細胞核的直徑大約是510ΜM，而線粒體的長度大約是2ΜM。DNA的寬度為2NM圖15。圖15幾種細胞結構的大小課程學習1細胞概述131水是細胞中最主要的物質13細胞的分子基礎生命是物質的，所有的細胞都是由水、蛋白質、糖類、脂類、核酸、鹽類和各種微量的有機化合物所組成表11。蛋白質、糖類、核酸和脂類等化合物也被稱為生物分子BIOMOLECULES。表11細菌細胞的化學組成化學成份占細胞的重量每種分子的類型數(shù)水701無機離子120糖及其前體1250氨基酸和前體04100核苷和前體4100脂肪酸和前體150其他的小分子02～300大分子蛋白質、核酸和多糖26～3000131水是細胞中最主要的成份生命來自于水，細胞中水的含量最高，通常占細胞總量70～80圖16。細胞中的所有反應都是在水中進行的，所以水是細胞生命的活動介質。圖16細胞中各主要成份的相對含量相鄰水分子間的關系是靠氫鍵維系的（圖17）。相鄰水分子間的關系是靠氫鍵維系的圖17，這種

簡介：1醫(yī)學細胞生物學專業(yè)攻讀碩士學位研究生培養(yǎng)方案醫(yī)學細胞生物學專業(yè)攻讀碩士學位研究生培養(yǎng)方案（專業(yè)代碼071009）一、培養(yǎng)目標一、培養(yǎng)目標1、培養(yǎng)德智體全面發(fā)展，在本專業(yè)具有堅實的理論基礎和系統(tǒng)的專業(yè)知識，熟悉科學研究的基本環(huán)節(jié)，能夠從事本專業(yè)教學和科學研究的高層次專門人才，并為進一步深造打下基礎。2、具有嚴謹?shù)目茖W態(tài)度和敬業(yè)精神；注重知識、能力和綜合素質的培養(yǎng)。3、掌握一門外語，有較強的聽說讀寫能力并能熟練地閱讀本專業(yè)的外文資料。4、身心健康。二、研究方向二、研究方向1、脂肪細胞生長與分化2、脂肪細胞的信號傳導與Ⅱ型糖尿病、肥胖癥的發(fā)病機制研究3、細胞周期有絲分裂的調控機制4、干細胞生物學與細胞的損傷和保護5、細胞神經生物學以細胞體外培養(yǎng)為基本手段，從細胞的整體、超微結構和分子水平來研究細胞的發(fā)育、分化、衰老、死亡及其與疾病的關系。探索前脂肪細胞生長分化的分子機制，尋找與Ⅱ型糖尿病及肥胖癥相關聯(lián)的基因；以體外培養(yǎng)的人腫瘤細胞、正常細胞系為實驗模型，研究細胞生長、分裂周期及死亡調控的分子機制，探討腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制及潛在的新型治療方法；神經干細胞、造血干細胞的分化及細胞的損傷與保護。三、學制與學習年限三、學制與學習年限全日制碩士研究生的學制為3年。四、培養(yǎng)方式四、培養(yǎng)方式碩士研究生培養(yǎng)施行導師負責制，提倡實行導師負責和導師組指導相結合，導師組由本專業(yè)及相關專業(yè)35名具有講師以上職稱人員組成。鼓勵“三種經歷”，即社會實踐經歷、第二校園經歷和海外經歷。研究生在第二校園經歷和海外經歷中取得的學分，與培養(yǎng)計劃內必修課內容及要求基本相同的，經導師認定后，提交醫(yī)學院學位分委員會討論認定，可以作為必修課成績，取得相應學分，培養(yǎng)計劃以外的課程可作為選修課學分認定。五、課程學習要求五、課程學習要求應修總學分不少于30學分，其中必修不少于18分，選修不少于10分。學習時間由3健康狀況等?？己撕细裾哌M入碩士論文研究與寫作階段；考核不合格者，按學校有關規(guī)定處理。七、科學研究與學位論文七、科學研究與學位論文11科研時間科研時間碩士研究生從事科學研究或學位論文工作的時間不少于一年半。2、開題報告、開題報告開題時間為第二學期。開題前必須完成對不少于30篇相關文獻的綜述，由導師組3位及以上成員進行審核，并給出評定、備案。開題報告必須在本學科或相關學科范圍內公開進行，由學科負責人或導師（指導小組負責人）組織3～5名相關學科專家對開題報告進行評議。開題報告內容包括選題的目的、依據(jù)，目前國內外進展的狀況，研究的基本內容，采用的方法與手段，預期達到的水平，科研的條件，可能出現(xiàn)的問題及解決的方法，進度安排，與本課題有關的工作積累、已有的研究工作成績；經費預算等。開題委員會專家對上述匯報給予評議，開題報告要求有文字記錄備案。3、中期檢查、中期檢查研究生在開題后的論文研究階段，必須向導師組（含相關專家）進行至少2次以上論文中期報告，考核組在審核原始資料和聽取匯報的基礎上給出評價，并對今后工作給予指導。中期檢查要求有文字記錄備案。4、預答辯、預答辯在提交學位論文答辯申請前1個月，由學院學位評定分委員會組織進行公開預答辯。預答辯委員會成員對碩士學位論文進行嚴格、認真的審查，詳細指出論文中存在的不足和問題，提出改進意見。預答辯所有要求（包括程序、時間）與正式答辯相同，有關預答辯工作按研究生院相關規(guī)定執(zhí)行。5、學術論文發(fā)表要求、學術論文發(fā)表要求碩士生在讀期間須作為第一作者（山東大學為第一作者單位）在核心A類刊物上發(fā)表學位論文研究相關論著（文章已被接受發(fā)表或清樣；文獻綜述和摘要等不計在內）1篇及以上；或作為共同作者之一發(fā)表SCI論文1篇（學位申請者與論文第一作者為同一導師學生，且第一作者及申請學位研究生所在單位為山東大學，不含綜述），且完成獨立的學位論文（必須有獨立的實驗數(shù)據(jù)，學位論文不得與他人重復），學位論文必須進行匿名外審（2份），通過后可申請學位。提前畢業(yè)要求提前畢業(yè)要求碩士研究生以第一作者（山東大學為第一作者單位）在SCI收錄期刊上發(fā)表與學位

簡介：DAPT及阿霉素對人乳腺癌MDAMB231細胞生物學活性的影響李志路，汪誠，楊亭，陳宸，劉勝春400016重慶，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內分泌乳腺外科［摘要］目的探討Γ分泌酶抑制劑DAPT及阿霉素對人乳腺癌MDAMB231細胞增殖、周期、凋亡的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)MDAMB231細胞至對數(shù)期，隨機分為對照組、DAPT組、阿霉素組及聯(lián)合用藥組。藥物處理24H后，CCK8法檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡率，WESTERNBLOT檢測NOTCH1，CYCLIND1，PTEN和BAX蛋白的變化。結果DAPT對MDAMB231細胞的抑制呈劑量依賴性。與DAPT組或阿霉素組比較，聯(lián)合用藥組抑制作用更強，G1期和凋亡細胞比例更多P005，伴有NOTCH1和周期蛋白CYCLIND1表達下降，抑癌基因PTEN和促凋亡蛋白BAX表達上調P005。結論DAPT與阿霉素協(xié)同抑制人乳腺MDAMB231細胞增殖，促進細胞凋亡。［關鍵詞］DAPT；阿霉素；MDAMB231［中圖法分類號］R3943R7379R73023［文獻標識碼］ADAPTENHANCESSENSITIVITYOFMDAMB231CELLSTODOXUBICINLIZHILUWANGCHENGYANGTINGCHENCHENDEPARTMENTOFENDOCRINETHEFIRSTAFFILIATEDHOSPITALOFCHONGQINGMEDICALUNIVERSITYCHONGQING400016CHINA［ABSTRACT］OBJECTIVETODETERMINEDTHEEFFECTOFDAPTDOXUBICINONCELLVIABILITYCELLCYCLEAPOPTOSISOFHUMANTRIPLENEGATIVEBREASTCANCERMDAMB231CELLSMETHODSMDAMB231CELLSWERETREATEDWITHDAPTDOXUBICINCOMBINATIONOFBOTHTHEEFFECTOFDAPTDOXUBICINONCELLPROLIFERATIONINVITROWASTESTEDBYCCK8ASSAY24HLATERTHECELLAPOPTOSISCELLCYCLEWASDETECTEDBYFLOWCYTOMETRYTHEEXPRESSIONOFNOTCH1BAXCYCLIND1PTENPROTEINWASDETECTEDBYWESTERNBLOTRESULTSMDAMB231CELLSEXHIBITEDGREATERGROWTHINHIBITIONAPOPTOSISWITHCOMBINATIONTHERAPYTHANSINGLEAGENTDAPTFACSVANTAGESE購自BD公司。12實驗方法121MDAMB231細胞培養(yǎng)及藥物處理MDAMB231在含有10胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，放置于37C、含5CO2培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的MDAMB231細胞，接種于96孔培養(yǎng)板上。DMSO溶解DAPT，對照組加入等體積DMSO，DAPT組加入10ΜMDAPT，阿霉素組加入10ΜGL阿霉素，聯(lián)合用藥組加入兩種藥物，DAPT先于阿霉素1H加入細胞中。培養(yǎng)液中DMSO終濃度小于01。每組設5個復孔，培養(yǎng)24H。每孔加入10ΜLCCK8溶液，2H后用酶標儀檢測450NM處的吸光度A，細胞活性用藥組A值對照組A值100，加藥過程中避光操作。122流式細胞儀檢測細胞周期分布取對數(shù)生長期MDAMB231細胞，接種于6孔培養(yǎng)板上，分組加藥方法同上。025胰酶消化細胞，PBS漂洗3次，75冰乙醇固定過夜，1000RMIN離心5MIN，棄乙醇，PBS漂洗3次，調整細胞濃度5105ML，加入1MLPI染液，4C孵育60MIN流式細胞儀檢測。123流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞分組加藥同上，整細胞濃度5105ML，入5ΜLFITC標記的ANNEXINV，30MIN后加入500ΜLBUFFER，混勻室溫避光反應30MIN，流式細胞儀檢測。124細胞總蛋白提取細胞分組加藥同上，收集細胞沉淀。加入150250ΜL含有蛋白酶抑制劑COCKTAIL和PMSF的RIPA裂解液，吹打混勻，直至充分裂解，在12000G離心10MIN，吸取上清液。BCA法測定蛋白濃度，于80C保存?zhèn)溆?，所有操作均在冰上進行。125WESTERNBLOT檢測細胞蛋白30ΜG蛋白加入上樣緩沖液100C煮沸10MIN，先以90V恒壓在5SDSPAGE濃縮膠中電泳，樣品進入10SDSPAGE分離膠后再改為120V，至溴酚藍染料泳動至距膠下緣1CM停止電泳。300MA恒流轉膜90MIN。將PVDF膜浸入5脫脂奶粉中封閉1H。加入11000一抗放置在脫色搖床上4C孵育過夜。洗膜后加入12000二抗，室溫孵育1H，洗膜后避光滴入超敏ECL化學發(fā)光液，室溫反應2MIN后顯影。ΒACTIN作為內參。13統(tǒng)計學方法

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簡介：水分,,生物體內的水分含量,通常占生物體重量的50～90％成年人體內水分含量58～67％；人體中水分含量隨年齡增大而減少；在體內分布亦不均衡。植物體內水分含量與分布也因植物種類、部位、發(fā)育狀況而異，變化很大,人體內水的分布,含水量隨年齡、性別不同而有差異新生兒75～80％；成年男子60％；成年女子50～55％；老年人40～50％各組織器官的含水量（％）,飲料中所含成分（100G可食部計）,蔬菜、水果中的含水量（100G可食部計）,本章主要內容,水和冰的物理特性及其在食品中的應用水和冰的結構水與溶質的相互作用及水分的存在狀態(tài)水分活度與水分的吸著等溫線水分活度與食品穩(wěn)定性冰在食品穩(wěn)定中的作用,水與冰的物理特性,水的熔點、沸點較高介電常數(shù)、表面張力、熱容和相變熱高黏度低、密度與溫度密切相關水結冰時體積增加，表現(xiàn)出異常的膨脹特性導熱性通常用導熱率和熱擴散系數(shù)表示；冰的導熱性優(yōu)于水,水的物理性質在食品加工中的作用,水分子極性大，分子小，能使許多食品成分分子表面帶有水膜水是食品加工中優(yōu)良的熱介質水的沸點高，且沸點隨壓力而變水的熱容大，載熱能力強（尤其水蒸氣）水的溶解能力強,水分子的結構,,水分子的締合,水分子的締合,,水分子的締合,水締合體的氫鍵結合程度受多重因素影響其中重要的是溫度和其它溶質的影響。溫度決定分子間距離配位數(shù),水和冰的結構,,冰的結構,,水和冰的結構,液態(tài)水的結構和冰的結構的區(qū)別在于它們的配位數(shù)和兩個水分子間的距離。水與冰結構中水分子之間的配位數(shù)和距離,水與溶質的相互作用,水與溶質的相互作用水與離子和離子基團的相互作用水與具有氫鍵鍵合能力的中性基團的相互作用水與非極性物質的相互作用食品中水分的存在狀態(tài),,水與離子和離子基團的相互作用,離子或離子基團通過自身的電荷與水分子偶極產生相互作用，稱為離子的水合作用。水合使離子轉變?yōu)樗想x子，離子的性質就發(fā)生了一定變化。,水與離子和離子基團的相互作用,水分子同NA的水和作用能約8368KJMOL1，是水分子之間氫鍵結合能的4倍。,水與離子和離子基團的相互作用,離子結構半徑大、電場強度弱的離子→與水作用力較弱→水化膜較薄半徑小、電場強度強的離子→與水作用力較強→水化膜較厚,水分子結構半徑大、電場強度弱的離子→與水作用力較弱→破壞水的網(wǎng)狀結構半徑小、電場強度強的離子→與水作用力較強→使水的網(wǎng)狀結構更趨緊密,水與具有氫鍵鍵合能力的基團的相互作用,水與溶質之間的氫鍵鍵合比水與離子之間的相互作用弱，與水分子間的氫鍵相近。當體系中添加具有氫鍵鍵合能力的溶質時，每摩爾溶液中的氫鍵總數(shù)不會明顯的改變。如果與溶質形成的氫鍵部位的分布和定向在幾何上與正常水的氫鍵部位是不相容的，具有結構破壞效應。,水與具有氫鍵鍵合能力的基團的相互作用,生物大分子中有許多可與水分子形成氫鍵的基團，水分子介入形成的氫鍵對生物大分子的結構與功能及食品功能性都有重要的影響。在生物大分子的兩個部位或兩個大分子之間可形成有幾個水分子所構成的“水橋”。,大分子中存在的“水橋”,,水與非極性基團的相互作用,非極性基團的物質疏水物質疏水基團與鄰近的水分子僅產生微弱的相互作用相互排斥，鄰近疏水基團的水比純水的結構更為有序疏水水合作用。疏水水合產生兩個結果籠形水合物蛋白質中的疏水相互作用,水與非極性物質的相互作用,非極性物質能和水形成籠形水合物水是這類化合物的“宿主”，它們靠氫鍵鍵合形成象籠一樣的結構，通過物理方式將非極性物質截留在籠中，被截留的物質稱為“客體”。為使疏水水合這種作用的熱力學不利變化降到最小，疏水基團盡可能相互聚集，使其同水分子接觸的機會降至最低限度疏水相互作用。,疏水水合作用的結果是促進了非極性物質之間的締合，從而減少水與非極物質的界面面積，這是一個熱力學上有利的過程（△G0），此過程稱為疏水相互作用,,疏水相互作用示意圖,（A）,（B）,,B,A,疏水水合,疏水相互作用,疏水相互作用是蛋白質折疊的主要驅動力,,水與溶質的相互作用,水溶質的相互作用分類,食品中不同狀態(tài)水的性質比較,食品中水分的存在狀態(tài),,,食品中水分的存在狀態(tài),,食品中水的存在形式,結合水一般包括化合水、鄰近水及幾乎全部多層水?；纤ńM成水、構成水）與非水物質結合最強的，并作為非水組份整體部分的水。鄰近水與非水組分的特異親水位置通過水－離子和水－偶極間的締合產生強烈的相互作用的水。多層水在鄰近水外層通過水－水和水－溶質間的氫鍵與非水組份緊密結合的水。,食品中水的存在形式,游離水（體相水）占據(jù)著與非水組份相距很遠位置的水；它們具有與稀溶液中的水相似的性質。持水力（持水容量）通常用來描述分子（一般是指低濃度存在的大分子化合物）構成的基體通過物理方式截留大量水，阻止水滲出的能力。持水力的變化對食品品質影響極大,食品中水的存在形式,水分活度,水分活度的定義AW＝F／FO≈P/PO≈ERH/100水分活度是樣品固有的一種性質；平衡相對濕度（ERH）是空氣與樣品中的水蒸汽達到平衡時大氣所具有的一種特性。水分活度隨溫度而變。一般溫度每變化10℃，AW變化003～02。水分活度與產品的種類（食品中的組分）有關。,水分活度與食品水分含量的關系,食品中水分活度與食品水分含量是兩個不同的概念。,AW07時若干食品中的含水量（G水/G干物質）,水分活度,高于和低于凍結溫度的水活性的三個重要區(qū)別凍結溫度以上，AW是樣品組分和溫度的函數(shù)，前者是主要的因素；但在凍結溫度以下時，AW與樣品中的組分無關，只取決于溫度。凍結溫度以上和凍結溫度以下水分活度對食品穩(wěn)定性的影響是不同的。低于凍結溫度時的AW不能用來預測凍結溫度以上的同一食品的AW。,水分活度,水分活度的測定方法水分活度儀測定恒定相對濕度平衡室法化學法相對濕度傳感器測定法冰點測定法,水分吸著等溫線,水分吸著等溫線又稱水分吸附等溫線，指在恒定溫度下，食品水分含量（用每單位干物質質量中水的質量表示）與水分活度的關系曲線圖，簡稱MSI。,水分吸著等溫線,吸附等溫線的分區(qū),等溫線區(qū)Ⅰ中的水食品中吸附最牢固和最不容易移動的水，靠水－離子或水－偶極相互作用吸附在極性部位。在區(qū)間Ⅰ的高水分末端位置的水相當于食品的“BET單分子層”水含量，它相當于與干物質牢固結合的最大數(shù)量的水。,等溫線區(qū)Ⅱ中的水多分子層水，主要靠水－水和水－溶質的氫鍵鍵合作用與鄰近的分子締合。向含有相當于區(qū)間Ⅰ和區(qū)間Ⅱ邊界位置水含量的食品中增加水，所增加的水將會使溶解過程開始，并且具有增塑劑和促進基質溶脹的作用。由于溶解作用的開始，引起體系中反應物移動，使大多數(shù)反應的速率加快。,吸附等溫線的分區(qū),吸附等溫線的分區(qū),等溫線區(qū)Ⅲ中的水是食品中結合最不牢固和最容易流動的水，即游離水。在凝膠和細胞體系中，因為體相水以物理方式被截留，所以宏觀流動性受到阻礙，但它與稀鹽溶液中水的性質相似；這部分水既可以結冰也可以作為溶劑，并且還有利于化學反應的進行和微生物的生長。,,水分吸著等溫線與溫度的關系一定的水分含量時，水活性隨溫度的上升而增大。,,滯后現(xiàn)象采用向干燥樣品中添加水（回吸作用）的方法繪制水分吸著等溫線和按除去水（解吸）過程繪制的等溫線并不重疊，這種不重疊性稱為滯后現(xiàn)象。,,滯后作用的大小、曲線的形狀和滯后回線的起始點和終止點都不相同，它們取決于食品的性質和食品除去或添加水份時所發(fā)生的物理變化，以及溫度、解吸速率和解吸時的脫水程度等多種因素。,水分活度與食品的穩(wěn)定性,,低于結冰溫度時冰對食品穩(wěn)定性的影響,食品中的水結冰時出現(xiàn)的兩個不利后果水結冰后，食品中非水組份的濃度將比冷凍前變大冷凍濃縮效應水結冰后，體積比結冰前增加9％,冷凍對食品穩(wěn)定性的有利方面低溫下微生物的繁殖被抑制溫度降低，大部分化學反應的反應速率降低,冰的凍結規(guī)律,純水的凍結曲線,蔗糖溶液的凍結曲線,不同凍結速率的食品物料的凍結曲線,冰的凍結規(guī)律,過冷狀態(tài)、晶核食品中含有一定水溶性成分，使食品的結冰溫度（凍結點）降低；隨著凍結量的增加，凍結點持續(xù)下降到更低，直到食品內溶液濃度增加到一定濃度后不再改變。低共熔點水和其溶解物開始共同向固體轉化的溫度。約－55℃～－65℃－18℃食品中絕大部分水已凍結－1℃～－4℃完成大部分冰的形成過程,冰的凍結規(guī)律,冰有11種結構，在常壓和0℃時，只有普通正六方晶系是穩(wěn)定的；冷凍食品中存在六方型、不規(guī)則樹枝狀、粗糙的球形和易消失的球晶四種主要冰晶體結構。水凍結時，冰晶體的大小和結晶速度受溶質、溫度、溫度降低速度等因素的影響冰晶的大小與晶核數(shù)目有關，形成的晶核越多則晶體越小。結晶溫度和結晶熱傳遞速度直接影響晶核數(shù)目的多少。溶質的種類和數(shù)量也會影響冰晶體的數(shù)量、大小、結構、位置和取向。,冷凍過程中溫度降低和溶質濃縮對化學反應速度的最終影響,,,,,冷凍過程中酶促反應被加速的例子,討論題（速凍食品）,速凍加工過程中凍結前需進行的處理凍結條件的要求及控制速凍食品的貯藏、運輸及保存對貯藏、運輸?shù)囊螅ɡ滏湹臏囟瓤刂疲┘彝ブ羞x擇和保存速凍食品的注意事項凍干食品工藝原理及食品特點,提出做法闡明原理、依據(jù),

簡介：細胞生物學實驗,海洋科學系劉均玲（13698999696）,實驗一細胞膜的滲透性,一、實驗目的與要求1掌握細胞膜通透性的實驗方法。2觀察并掌握相對分子量、脂溶性大小、電解質和非電解質對細胞膜通透性的影響。,細胞膜在不斷變化的環(huán)境中必須保持自身的穩(wěn)定狀態(tài)才能生存。細胞膜允許一些物質通透，又能降低甚至阻止另一些物質的通透，所以細胞膜具有選擇通透性。,二、實驗原理,未溶血,溶血,血紅蛋白從紅細胞中逸出的現(xiàn)象稱為溶血現(xiàn)象。滲入紅細胞的溶質能提高紅細胞滲透壓，使水進入紅細胞，引起溶血及細胞膜破裂。此時光線較容易通過溶液，使溶液呈現(xiàn)透明即溶血。,二、實驗原理,二、實驗原理,在不同相對分子量、脂溶性大小以及電解質和非電解質等各種溶液中，紅細胞質膜對各種溶質的滲透性不同。由于溶質透入速度不同，溶血時間也不同。因此，通過觀察紅細胞溶血現(xiàn)象時間的不同來記錄滲入速度，從而測量各種物質通透性的差別。,三、實驗材料、儀器和主要試劑,1實驗材料雞血。2實驗器材小燒杯，試管，試管架，刻度吸管，注射器，秒表等。3試劑09生理鹽水；2種低滲溶液0017MOL/L氯化鈉和0032MOL/L葡萄糖；10種等滲溶液017MOL/L氯化鈉、032MOL/L葡萄糖、017MOL/L氯化銨、017MOL/L醋酸銨、017MOL/L硝酸鈉、012MOL/L草酸銨、012MOL/L硫酸鈉、032MOL/L甘油、032MOL/L乙醇、032MOL/L丙酮。,50兔紅細胞懸液的制備（制備流程如下）以無菌方法抽取雞靜脈血液（1ML兔血加09生理鹽水9ML）混勻，離心（3000RPM）5MIN棄上清取沉淀加09生理鹽水，離心（3000RPM）5MIN，重復3次棄上清取沉淀，用生理鹽水稀釋，制成50雞紅細胞懸液備用,,,,四、實驗方法與步驟,,,,,,四、實驗方法與步驟,溶血現(xiàn)象的觀察取試管2支，分別加入0017MOL/L氯化鈉和0032MOL/L葡萄糖低滲溶液3ML，再加入2滴制備好的50雞紅細胞懸液，注意觀察溶液顏色的變化，由不透明的紅色懸液變成透明的血紅蛋白溶液（紅細胞發(fā)生破裂，造成100紅細胞溶血，使光線比較容易透過溶液）。,四、實驗方法與步驟,紅細胞的滲透性（1）取試管一支，加入017MOL/L氯化鈉溶液3ML，再加入2滴制備好的50雞紅細胞懸液，輕輕搖動，混勻后靜置于溫室中，觀察試管中發(fā)生溶血的時間及其變化。注意是否有顏色變化是否有溶血現(xiàn)象為什么,四、實驗方法與步驟,（2）分別在下列幾種等滲溶液中進行實驗，步驟同（1）。032MOL/L葡萄糖017MOL/L氯化銨017MOL/L醋酸銨017MOL/L硝酸鈉012MOL/L草酸銨012MOL/L硫酸鈉032MOL/L甘油032MOL/L乙醇032MOL/L丙酮,五、注意事項,試管中有紅細胞和測試溶液時，不應強力搖晃，以免造成人為的紅細胞破裂。目測法判斷標準快速溶血＋＋＋；慢速溶血＋＋或＋；不溶血－。溶血現(xiàn)象可用一張有字的白紙來輔助識別，能夠清楚地透過溶液看到溶液后方紙上清晰的字跡時，為完全溶血。因相對分子質量大小對膜通透性有影響，所以將溶血時間適當?shù)匮娱L至15MIN，15MIN時仍然不溶即判斷為不溶血。,,六、作業(yè),記錄觀察到的現(xiàn)象，并對實驗結果進行分析和比較。,實驗二雞血細胞的體外融合試驗,一、實驗目的與要求,掌握PEG體外誘導細胞融合的原理和基本方法。掌握在光學顯微鏡下融合細胞的形態(tài)特征。,細胞融合是用人工的方法使兩個或以上的細胞融合成異核細胞。異核細胞可進入有絲分裂，使來自兩個親本細胞的基因組合在一起，形成只含一個細胞核的雜種細胞。,二、實驗原理,PEG溶液作為助融劑可改變各類細胞的膜結構，使兩細胞接觸點處脂類分子發(fā)生疏散和重組，引起細胞融合。,二、實驗原理,細胞融合的頻率和活力與所用PEG的分子質量、濃度、作用時間以及細胞的生理狀態(tài)及密度等有關。本方法用分子質量為400～6000的PEG溶液可引起細胞的聚集和粘連，產生高頻率的細胞融合。,二、實驗原理,三、實驗材料、儀器和試劑,1材料成年家雞。2主要儀器注射器、刻度離心管、離心機、血細胞計數(shù)板、水浴鍋、滴管、顯微鏡、燒杯、容量瓶、凹面載玻片、蓋玻片、酒精燈等。3主要試劑085NACL溶液、GKN液、50（W/V）PEG400溶液、HANKS液、05酚紅、JANUSGREEN染液等。,1雞血細胞懸液的制備從家雞的翼根靜脈采血制備抗凝全血。加入4倍體積的085NACL溶液，制成紅細胞儲備液，保存于4℃。取雞血細胞儲備液1ML，加入4ML085NACL溶液，混勻后，1200RPM離心5MIN，棄去上清液，再加入5ML085NACL溶液按上述條件離心一次。最后，棄去上清液，加入10ML的GKN溶液制成雞血細胞懸液。取05ML雞血細胞懸液，用GKN溶液稀釋至1X107個/ML，備用。,四、實驗方法與步驟,2雞血細胞的收集吸取1ML雞血細胞懸液放入離心管中，加入4MLHANKS液混勻，1000RPM離心5MIN。棄去上清液，用手指輕彈離心管底部，使沉淀的血細胞團塊松散。3PEG誘導細胞融合吸取05ML37℃的50PEG溶液，慢慢沿著離心管壁逐滴加入，邊加邊輕搖離心管，使PEG與細胞混勻，然后在37℃水浴中靜置2MIN。,四、實驗方法與步驟,4終止PEG作用緩慢加入5MLHANKS液，輕輕吹打混勻，于37℃水浴中靜置5MIN。5細胞懸液的制備用吸管輕輕吹打細胞團數(shù)次使細胞團分散，1000RPM離心5MIN，使細胞完全沉降。棄去上清液，加HANKS液，再離心一次，棄多數(shù)上清，留少許溶液，混勻。,四、實驗方法與步驟,,四、實驗方法與步驟,6計算細胞融合率細胞融合率是指在顯微鏡的視野內，已發(fā)生融合的細胞其細胞核總數(shù)與該視野內所有細胞的細胞核總數(shù)之百分比。融合率視野內融合細胞的核數(shù)/視野內細胞的總核數(shù)100％,,7染色和鏡檢吸取細胞懸液，在凹面載玻片上滴一滴，加入JANUSGREEN染液混勻，染色3MIN后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細胞融合情況（注意區(qū)分細胞融合與細胞重疊）。,四、實驗方法與步驟,五、注意事項,1高CA2濃度能夠提高細胞融合率。有些抗凝劑中含有和CA2結合的化合物，與血液中的CA2形成難解離的可溶性絡合物，導致血液中的CA2濃度降低，故起抗凝血作用，但同時會造成細胞的融合率較低。2必須嚴格控制PEG的作用時間，通常處理細胞1～2MIN。PEG和二甲基亞砜（DMSO）并用，可以提高細胞的融合率。3融合細胞繼續(xù)培養(yǎng)就變成一個雜種細胞，它的染色體數(shù)不是兩核的倍數(shù)，因為一些染色體會逐漸消失。,六、作業(yè),繪細胞融合過程圖。,實驗三石蠟切片法,一、實驗目的,熟悉石蠟切片的制作過程。掌握HE染色的基本原理和染色方法。,二、實驗原理,石蠟切片是最基本的切片技術，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發(fā)展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱HE對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長期保存。經過HE染色，細胞核被蘇木素染成藍紫色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。,三、實驗用品,1器材切片機、水浴鍋、染色缸、玻片、顯微鏡、試劑瓶、剪刀、鑷子、烘箱、離心管或青霉素瓶子。2試劑蘇木色精、伊紅、二甲苯、中性樹膠、酒精、石蠟、氨水、鹽酸、蛋清、甘油。3試驗材料羅非魚肝臟組織,四、實驗步驟,1、取材2、固定3、漂洗4、脫水5、透明6、透蠟7、包埋8、修塊9、切片10、染色,1取材到切片,取材固定（CANNOY’S），材料厚度2MM。100酒精100酒精二甲苯酒精（11）二甲苯二甲苯二甲苯石蠟（65℃11）石蠟（65℃）石蠟（65℃），以上處理各20MIN，最后一步石蠟也20MIN。包埋修塊切片貼片,2脫蠟與復水,二甲苯二甲苯二甲苯/無水乙醇1/1無水乙醇無水乙醇95乙醇80乙醇70乙醇50乙醇蒸餾水。以上處理各23MIN。,3染色與觀察,1蘇木色精（5MIN）水洗05鹽酸分色（數(shù)秒）水洗04氨水藍化水洗（5MIN）70酒精80酒精1伊紅（95酒精溶解）95酒精95酒精100酒精100酒精酒精/二甲苯二甲苯二甲苯中性樹膠封片。未注明時間的一律處理23MIN。,五、作業(yè),簡述石蠟切片過程，繪制你所觀察到的細胞形態(tài)。提交一張你制作較好的玻片。,實驗四植物細胞骨架的觀察,,一、實驗目的,掌握考馬斯亮藍R250對植物細胞骨架染色的方法。通過對洋蔥內皮細胞的處理，掌握植物細胞骨架的制備方法與顯微形態(tài)觀察。,二、實驗原理,細胞骨架CYTOSKELETON，是細胞內以蛋白質纖維為主要成分的網(wǎng)絡結構，根據(jù)蛋白質纖維的直徑、組成成分和組裝結構的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細胞骨架對于維持細胞的形態(tài)結構及細胞運動、物質運輸、能量轉換、信號傳導和細胞分裂等有重要的作用。本試驗采用去垢劑TRITONX100的緩沖液處理植物材料時，可將細胞的膜結構和大部分蛋白質抽提掉，但細胞骨架系統(tǒng)的蛋白卻被保存下來，后者用考馬斯亮藍R250染色，在光學顯微鏡下可見一種網(wǎng)狀結構。,三、實驗用品,1試驗材料洋蔥2器材顯微鏡、載玻片、滴管、擦鏡紙、PH計3試劑001MOL/L磷酸鹽緩沖生理鹽水PBS02MOL/LNA2HPO4NAH2PO4緩沖液（PB，PH73）50ML、015MOL/LNACL、加雙蒸餾水加至1000MLPB02MOL/LNA2HPO477ML02MOL/LNAH2PO423ML,M緩沖液咪唑PH6750MMOL/LKCL50MMOL/LMGC1205MMOL/LEGTA1MMOL/LEDTA01MMOL/L巰基乙醇1MMOL/L甘油4MMOL/L用1MOL/LHCL調PH至72。,,1的TRITONX100/M緩沖液02考馬斯亮藍R250染液甲醇465ML冰醋酸7ML蒸餾水465ML3戊二醛PB溶液（PH73）,四、實驗步驟,取洋蔥內皮1CM左右置于含PBS液的載玻片上濕潤后，吸去PBS加2滴1TRITONX100/M緩沖液，5MIN吸去緩沖液，加3戊二醛PB溶液，固定30MIN加PBS洗2次，共3MIN加02考馬斯亮藍R250染色30MIN用PBS洗2次，共2MIN，吸干鏡檢并繪圖,,,,,,,,,五、注意事項,用去垢劑TRITONX100的緩沖液處理材料時，應控制在30MIN左右。每一次加液或染色后，應用PBS洗2次，并用濾紙吸干。,六、作業(yè),畫出實驗所觀察到的細胞骨架圖，并注明放大倍數(shù)。為什么用TRITONX100的緩沖液處理材料,現(xiàn)在請開始實驗謝謝,

簡介：細胞微生物學研究方法,前言,人們僅確知一小部分細菌可導致人類疾病。這些細菌一般可分為兩類致病菌和條件致病菌。醫(yī)療手段不斷提高，抗生素的研制也在不斷發(fā)展，但由各種病原體所導致的疾病仍有很高的發(fā)病率和致死率。越來越多耐藥性病原體的出現(xiàn)可能使我們很快進入一個“后抗生素期”。更好地理解病原體的毒力機制和疾病中病原宿主相互作用可為治療疾病確立新的靶。我們應該發(fā)展更多的新的分子生物學技術來研究細菌的各個組分，確定細菌的毒力因子。,KOCH’SPOSTULATES,1890年,KOCH要想確定一種疾病是由于某種微生物的感染所引起，必須滿足4項條件一、每一例病人體內都可以分離到該病菌。二、該病菌可以在體外培養(yǎng)數(shù)代。三、培養(yǎng)了數(shù)代的細菌可以使實驗動物引發(fā)同樣的疾病。四、被接種的動物中可以分離到同樣的病菌。,MOLECULARKOCH‘SPOSTULATES,基因可以在有確定毒力表型的菌株中發(fā)現(xiàn)；基因突變后表型喪失；再導入該基因將在突變株中重建該表型。,STANLEYFALKOWMOLECULARKOCH‘SPOSTULATESAPPLIEDTOMICROBIALPATHOGENICITYREVINFECTDIS198810S2S2746,常用的體外微生物實驗技術常用的體內微生物實驗技術,DNA突變重組差異表達研究技術MICROARRAY基因芯片,常用的體外微生物實驗技術,突變分析,突變MUTATION細菌的基因結構發(fā)生偶然的改變。細菌的自然突變率與其生物的自然突變相同，每106～108次細胞分裂發(fā)生一次。細菌每20～30分鐘分裂一代，故突變株相對較多。細菌中點突變較多見。當突變發(fā)生在DNA一對或少數(shù)幾對堿基引起改變時，稱為點突變。,突變分析,1定向突變（DIRECTEDMUTATION）是用于評價特異細菌基因產物毒力分布的最廣泛技術。在一種稱為“反向遺傳學”的技術中，編碼假定毒力因子的基因被插入滅活或基因替代所破壞，然后比較同源突變株與親代株的毒力。這一技術需要將DNA介導入病原體內，還需要合適的選擇性標記以及同源重組的天然能力。,在定向突變中，抗生素耐受標記或其他選擇性標記連于靶基因克隆復制物的編碼序列內，這就破壞了基因的正常轉錄和翻譯，并為選擇重組子提供了標記。接著，重組子被介導入靶病原體，并與細菌染色體的同源區(qū)進行重組。如果耐受標記兩側是染色體特異序列，就會發(fā)生雙重交叉（DOUBLECROSSOVER），標記基因整合入染色體序列，而載體序列不整合。,定向突變,蔗糖敏感標記在HPYLORIVACA基因中導入突變的方法,PCRHPYLORIFLAA啟動子區(qū)、無啟動子的SACB基因，卡那霉素耐受基因（KAN）,構建KANSACBCASSETTE,插入PEK，得到PENKSF,195KB的VACA基因（ECORⅠKPNⅠ）克隆入PBLUESCRIPTKS載體，構建PEK,與細菌染色體的同源區(qū)進行雙交換重組,突變的VACA菌株,定向突變,隨機突變,傳統(tǒng)的方法使用UV或化學試劑在細菌基因組內造成核苷酸的改變，導致基因表達的變化。缺點沒有合適的方法來篩選減毒株和突變的基因細菌轉座子TRANSPOSON轉座子是存在于染色體DNA上可自主復制和位移的基本單位，常通過產生插入突變影響基因的調控與表達，導致細菌生物學性狀或毒力等的改變。轉座子誘變技術已被廣泛用于細菌分子遺傳學研究，包括3個步驟將轉座子插入靶基因；篩選感興趣的突變體，并證實該突變是由轉座子插入引起的；確定并克隆靶基因。優(yōu)點不需要鑒定待測基因的產物，只要轉座基因插入可引起表型發(fā)生變化的基因均可用此法分離鑒定。,二、差異表達研究,分離微生物差異表達基因MRNA差異顯示技術差減雜交和抑制差減雜交CDNA代表性差異分析基因鑒定集成法,二、差異表達研究,1MRNA差異顯示技術DDPCRMRNADIFFERENTIALDISPLAYREVERSETRANSCRIPTIONPCR是建立在基因差別表達的基礎上，通過比較不同的個體之間MRNA的差異，應用反轉錄PCR技術而發(fā)展起來的一種分離未知基因的方法。缺點重復性差、假陽性高、差異片段短小等。,2、差減雜交和抑制差減雜交,差減雜交SUBTRACTIVEHYBRIDIZATION，SH）STRAUS等于1990年首次用于微生物研究野生株酵母與變異株酵母進行消減雜交。抑制差減雜交（SUPPRESSIONSUBTRACTIVEHYBRIDIZATION,SSH）1996年DIATCHENKO在SH基礎上進一步改善。,差減雜交的原理,提取待比較的兩種基因組DNA,待于尋找差異DNA的稱為實驗株（TESTER）,,另一方作參考，稱為驅動株（DRIVER）,,,在雜交前連接接頭和TESTERDNA，并用生物素標記DRIVERDNA。,保證TESTERDNA序列較短,雜交,雜交后，含有DRIVERDNA的雜合子可通過鏈親和素的吸附作用而移去,接頭序列為引物，用PCR擴增剩余的序列，也就是僅存在于TESTERDNA中的序列,重復一次,將PCR序列克隆入載體中，產生差減文庫,抑制差減雜交技術（SSH）,將TESTERDNA分為兩部分，各自在5’端接上不同的接頭,,DRIVERDNA雜交的序列應均被清除，只留下TESTER特異的單鏈序列,用與接頭序列結合的引物進行PCR擴增抑制效應兩端含有相同接頭的序列由于形成二級結構阻止了引物的退火，只有兩端含有不同接頭的E分子得以擴增。,單鏈TESTERDNA,雙鏈TESTERDNA,TESTERDNA和DRIVERDNA形成的異源雙鏈分子,DRIVERDNA單鏈及自身退火的雙鏈分子,第二輪雜交。將兩份雜交產物混合并進行第二次雜交，產生第5種新的雙鏈分子E，它的兩個5’端連有兩個不同的接頭，兩條鏈均為TESTERDNA特異鏈,將PCR序列克隆入載體中，產生差減文庫,SH在微生物研究中的應用,檢測毒力島，尋找毒力有關基因。檢測不同菌株表達的不同；同一株菌在不同條件下表達的不同。檢測有毒株與無毒株的基因差異，研究毒力的改變如黏附性、侵襲性。2000年用SH方法檢測有毒株TB和無毒株TB表達的不同，或高表達的基因。發(fā)現(xiàn)了DEVR和DEVS與毒力有關。B組鏈球菌主要分為III1,2,3株，其中III3最易感染新生兒，說明毒力最強，用SH將它與III－2、1進行雜交，發(fā)現(xiàn)9個短特異序列，可能與毒力有關。,SH技術的缺陷,表達量很低的差異MRNA也很難被擴增。所以一些量少的基因不作為SH的檢測對象，如轉錄因子，細胞因子，受體等。要檢測出表達量的不同要高于5倍才行。一些重要的差異基因可能會漏過。SH主要檢測在GC％豐富的菌中GC％含量低的區(qū)域。SH無法將兩個菌的不同基因都測出，得到的產物不全是差異基因。要考慮用其他技術補充。,3、CDNA代表性差異分析CDNARDACDNAREPRESENTATIONDIFFERENCEANALYSIS,綜合了差減雜交和差別顯示兩項技術的優(yōu)點，并充分利用PCR反應的特性，達到特異性擴增目的基因的目的。原理每次對兩個CDNA代表群進行差減雜交前都更換特定的接頭和引物,利用PCR以指數(shù)形式擴增雙鏈模板（帶有特定接頭的TESTERDNA），而僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性，從而使得只有差異表達的基因片段得到高度富集。,CDNARDA,4、基因鑒定集成法IPGICDNAREPRESENTATIONDIFFERENCEANALYSIS,是對以往各種相關技術的一種有效的綜合。在目前表達序列標簽EXPRESSEDSEQUENCETAGS,ESTS計劃發(fā)展的基礎上，總結了現(xiàn)有的各種基因差別表達分析技術的優(yōu)缺點，將DDPCR、SSH、SAGE和基因數(shù)據(jù)庫技術進行了有機結合。特點TESTER有兩種不同的接頭，在差減雜交中只有代表稀有拷貝基因且兩端帶不同接頭的CDNA片段才能以指數(shù)擴增，使得目的序列得以高度富集；只回收3’CDNA，從而最大限度地利用ESTS數(shù)據(jù)庫。,三、基因芯片,基因芯片是指通過微加工技術將大量的DNA以預先設計的排列方式有序地固定在載體表面，形成儲存有大量信息的DNA陣列。檢測時，首先用不同條件下培養(yǎng)的細菌的RNA為模板，以放射性同位素或熒光標記的DNTP為底物反轉錄合成CDNA。再用所得CDNA與DNA芯片進行雜交，然后通過計算機對結果進行判讀和處理，這樣就可以找到條件變化時基因表達的情況。,基因芯片應用,微生物比較基因組學研究微生物基因表達譜研究微生物檢測鑒定研究,MICROARRAY特點,規(guī)?；瘷z測PCR基礎的MICROARRAY不能檢測到點突變和嵌合基因存在一定假陽性率和假陰性率，需用其他方式驗證,,問號鉤體基因組DNA芯片的組成,鉤體賴株在GENBANK中共注釋了4727個基因，鉤體DNA芯片上共包含了3528個ORFS，每個ORF在芯片上有三個重復。每張芯片還包含了相應的陽性對照點（鉤端螺旋體代謝相關基因）及陰性對照點（棉花和人的基因）。,STMIVETDFIIVEATGAMBIT,常用的體內微生物實驗技術,體內誘導基因INVIVOINDUCEDGEN，IVIGENE,僅在微生物進入宿主體內后才被誘導表達在體外生長時不表達的獨特基因。往往能增強其在宿主體內的生存能力，致病性甚至決定著細菌毒力強弱，極有可能是病原菌在宿主體內生長、繁殖及致病的關鍵基因，也是潛在的抗生素作用靶點、診斷抗原以及疫苗候選者，具有重要的研究價值。隨著分子生物學技術及分子遺傳學研究手段的發(fā)展，依賴動物模型的IVET、DFI、STM以及不依賴感染動物模型的IVIAT等研究方法的發(fā)明及成功運用使得針對微生物IVIGENE的研究成為可能。,是一種基于轉座子的突變技術。是由HOLDEN及其同事于1995年在研究傷寒鼠沙門氏菌時建立起來的，用來鑒定能使病原體在宿主體內成功存活和繁殖的決定性基因。在病原體的基因組中隨機插入特異性信號標簽，與病原體致病有關的毒力基因中由于插入轉座子而失活，無法在宿主體內生存、繁殖。通過突變體庫感染宿主，然后對未存活的突變體進行負篩選就可篩選出毒力基因失活的突變體菌株。,信號標簽誘變（STM）SIGNATURETAGGEDMUTAGENESIS,STM技術TAGS的構建可變區(qū)40BP，由4個堿基隨機排列而成，理論上可形成1012種不同DNA片段。,,STM的特點,通過聯(lián)合轉座子插入誘變技術和體內負篩選原則使篩選策略由原來針對單個突變株的逐一鑒定轉變?yōu)獒槍碗s突變體群的系統(tǒng)篩選，篩選過程更為快捷與系統(tǒng)；特異性DNA序列對突變體的逐一標記也能輕易地鑒定出被突變的基因，將工作量和實驗動物用量降到最低。,STM的局限性,一是插入性誘變實驗存在的共同局限性，如插入事件存在隨機性，使得某些較小基因片段400BPS的插入性轉座誘變較難實現(xiàn)；某些基因區(qū)域本身為體內轉座或重組的熱區(qū)或冷區(qū)也影響著轉座誘變作用的成功率；需要建立能方便地從其感染器官組織中回收尚且存活的細菌突變株的合適動物模型等。另一方面的局限性則為STM技術所特有，包括標簽信號衰減的影響；眾多突變體株同時收集并實驗可能導致其中某些單一信號的削弱，從而影響結果可靠性；另外，由于多個突變株同時存在并共同作用，突變株之間的缺陷代償可能導致某些突變基因不能被篩選與鑒定，出現(xiàn)假陰性結果等。,體內表達技術INVIVOEXPRESSIONTECHNOLOGY，IVET,利用病原基因組隨機片段與缺乏啟動子的報告基因構建融合載體（啟動子誘捕文庫），在動物體內重組到細菌基因組中而使報告基因表達，篩選病原菌感染過程中表達基因的方法。采用常規(guī)的分子生物學技術即能進行篩選，不需要昂貴的儀器設備，優(yōu)勢明顯；不需要對目標病原菌的基因組特性進行深入詳細的認識即可對細菌在宿主環(huán)境條件下的基因表達情況進行分析研究。,EXAMPLE鼠傷寒沙門菌PURA缺陷型模型PURA基因作為可選擇的報告基因；LACZ基因（編碼Β半乳糖苷酶）供體外選擇。,差異熒光誘導（DFI）,以GFP為報告基因來監(jiān)測啟動子活性。將GFP編碼基因置于目標病原菌啟動子文庫的下游，采用熒光激活細胞分選術對包含有啟動子GFP融合活性的菌落與不能表達GFP的菌落進行分離，通過對體內及體外環(huán)境中熒光細胞的連續(xù)分離與比較以確定僅在體內環(huán)境中存在的細胞及相應的突變基因。,GFP基因編碼一種水母蛋白綠色熒光蛋白（GFP），在受到藍光激發(fā)后會發(fā)出綠色熒光。GFP的一個重要特征是它的熒光信號能通過FACS來檢測，這意味著含有與GFP基因融合的啟動子庫的細菌可自動篩選出活化的啟動子，這樣成千上萬的啟動子可在數(shù)分鐘內被分離。FACS還能分選表達GFP的細菌粘附或內在化的真核細胞，使檢測由于和宿主細胞相互作用而激活的細菌基因成為可能。,將熒光激活細胞分選術和基因組學研究進行整合，對微生物基因表達情況進行高通量的半自動篩選，操作簡單、迅速、實驗重復性高；具有熒光性質穩(wěn)定，無細胞毒性，不干擾細菌在宿主體內的侵襲、擴散和增值過程，可直接用于活細胞測定等優(yōu)點。GFP的運用使研究者能對基因的表達情況及單細胞水平的啟動子活性進行客觀觀察與分析，并可通過簡單改變熒光閾值來調節(jié)選擇敏感性。,DFI的特性,不能檢測需要轉錄后調節(jié)的基因；需要構建和分析目標基因突變株以評估靶基因在天然感染中的作用；細菌的聚集與粘附可能影響流式細胞分類與檢測分析；研究環(huán)境的PH變化、氧氣供給情況以及缺乏信號放大效應等也會影響GFP的使用；由于熒光為非線性信號，每次實驗時都需要對信號的線性范圍進行檢測和校準以確保準確量化基因的表達情況；采用細胞模型，不適用于動物模型的篩選，因此篩選結果不夠全面，不能反映致病菌感染的全部環(huán)節(jié)。,DFI的缺陷,體內誘導抗原技術IVIAT（INVIVOINDUCEDANTIGENTECHNOLOGY）,直接從“蛋白”角度入手篩選毒力基因HANDFIELD及其合作者于2000年在研究口腔病原菌時設計提出，通過對表達文庫進行免疫篩選得到病原菌的體內誘生基因。作為一種簡單有效的篩選技術，IVIAT已被成功用于多種病原微生物IVIGENE的研究中，如豬鏈球菌、炭疽桿菌、傷寒沙門氏菌以及白色念珠菌等等。,體內誘導的抗原技術,取感染過所研究病原體的多個病人的血清，用體外生長的該病原細胞將相應抗體全部吸收，只留下僅在體內表達的抗原的相應抗體。,在合適的宿主中建立該抗原DNA的表達庫,用吸收后血清探測這些克隆,有反應的克隆即產生自然感染而非體外培養(yǎng)過程中表達的抗原，通過純化、測序，即可鑒定體內誘導的抗原基因。,將這些抗原純化，用于證實IVI抗原確由病原體在感染過程中表達。,IVIAT的特點,IVIAT不依賴于動物模型，而是以急性感染患者的恢復期血清為探針篩選病原菌的IVIGENE，應用范圍廣泛，可真實全面地反映病原菌與人類感染宿主之間的相互作用。僅使用簡單的免疫學和常規(guī)基因組克隆技術即可快速及時對病原菌基因組進行系統(tǒng)篩選，不需要對目的病原菌基本遺傳學背景進行詳細了解，尤其適用于一些新現(xiàn)病原菌的致病性研究。所需生物學材料極少，僅需采集受染患者的恢復期血清或少量含有病原菌的受染組織或體液成分即可進行，血清庫的建立使研究人員可以最大程度獲得病原菌不同途徑感染和感染不同階段的抗原。,IVIAT的缺陷,僅適用于可培養(yǎng)病原微生物；具抗體反應依賴性；對于一些不具免疫原性或某些細菌在體內體外生存都必需的毒力基因表達產物不能很好鑒別；不能自動化操作；會受到免疫交叉反應的影響而造成假陽性，因此IVIAT的陽性菌落需要經過多次重復篩選，還需用陰性感染血清為對照以確保免疫反應的特異性。,4種細菌毒力基因篩選技術方法的比較,體外轉座進行基因組分析和作圖GAMBITGENOMICANALYSISANDMAPPINGBYINVITROTRANSPOSITION,鑒定基因組已經被測序的微生物中對于病原菌的生長體內/體外是必需的基本基因。,ASTRATEGYFORPRODUCINGCHROMOSOMALMUTATIONSBYUSINGINVITROTRANSPOSONMUTAGENESIS,ASPECIFICREGIONOFTHECHROMOSOMEISAMPLIFIEDBYEXTENDEDLENGTHPCR,ANDSUBJECTEDTOINVITROTRANSPOSONMUTAGENESISTHERESULTANTPOOLOFMUTAGENIZEDDNAISTHENTRANSFORMEDINTOBACTERIA,WHICHARETHENGROWNUNDERSELECTIVECONDITIONSEGONDEFINEDMEDIUMORINANANIMALPCRISTHENPERFORMEDONTHEPOSTSELECTIONPOOLUSINGATRANSPOSONSPECIFICPRIMERANDAPRIMERTOAKNOWNLOCATIONONTHECHROMOSOMESUBSEQUENTANALYSISOFTHEPCRPRODUCTSALLOWSDETERMINATIONOFWHICHGENESINTHATREGIONOFTHECHROMOSOMEAREREQUIREDFORSURVIVALUNDERTHOSESELECTIVECONDITIONS,BGENETICFOOTPRINTINGFORDETECTIONOFESSENTIALGENES,GAMBIT提供了一種有力的手段在那些比體外豐富培養(yǎng)基環(huán)境要嚴格得多的環(huán)境下鑒定病原生長或生存的必須基因，目前已經被成功運用于鑒定流感嗜血桿菌、釀酒酵母、肺炎鏈球菌等病原的基本基因。GAMBIT雖然是應用在基因組水平的分析，它仍然可以針對某段感興趣的特別的特定DNA元件或染色體區(qū)域進行操作，例如噬菌體和毒力島等。,GAMBIT的特點,噬菌體展示技術PHAGEDISPLAYTECHNIQUES,PDT）,噬菌體（BACTERIOPHAGE）是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，部分能引起宿主菌的裂解，具有基因和結構單一性的特點。PDT是一種將外源肽或蛋白質與特定噬菌體衣殼蛋白融合并展示于噬菌體表面的技術。它將外源基因插入到噬菌體展示載體的信號肽基因和衣殼蛋白編碼基因之間，從而使外源基因編碼的多肽或蛋白質與外殼蛋白以融合蛋白質形式展示在噬菌體表面，被展示的外源肽或蛋白質可保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。探測蛋白空間結構、探索受體與配體之間相互作用結合位點、確定抗原表位、尋找高親和力和生物活性的配體分子。,PDT原理,主要包括三方面內容通過DNA重組的方法插入外源基因，形成的融合蛋白表達在噬菌體顆粒的表面，同時保持外源蛋白的天然構象，不影響噬菌體的生活周期，也能被相應的抗體或受體所識別；篩選目的噬菌體，利用固定于固相支持物的靶分子，采用適當?shù)奶韵捶椒?，洗去非特異結合的噬菌體，篩選出融合噬菌體；外源多肽或蛋白質表達在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導出來。,PDT,PDT局限性,在噬菌體展示過程中必須經過細菌轉化、噬菌體包裝，有的展示系統(tǒng)還要經過跨膜分泌過程，大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質功能的實現(xiàn)需要折疊、轉運、膜插入和絡合，導致在體內篩選時需外加選擇壓力。噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細胞內基因的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。,

簡介：醫(yī)學細胞生物學實驗簡介,醫(yī)學細胞生物學是一門實驗性較強的學科，它的任何一項新成果取得都離不開實驗。在21世紀生命科學領域中，更加顯示出細胞生物學技術的重要性和引導科學發(fā)展前沿性。在醫(yī)學理論研究及臨床實踐研究中也起著極大的作用，尤其是目前醫(yī)學面臨的惡性腫瘤等重大醫(yī)學問題，最終解決也要依賴細胞生物學研究的突破。,醫(yī)學細胞生物學實驗簡介,對細胞生物學教學來說，實驗課程是一個非常重要組成部分，學生的基本技能，動手能力，創(chuàng)新和探索意識都要通過實驗課來實現(xiàn)，尤其培養(yǎng)學生的綜合科研素質顯得更為重要。本實驗方法在當前是常用而先進（或改良優(yōu)化）的方法。實驗包括了實驗目的、原理、方法、結果與分析、作業(yè)等。,實驗項目設置與內容提要,實驗一光學顯微鏡的使用與細胞形態(tài)結構的觀察,一、目的要求1掌握光鏡的正確使用；2掌握光鏡下各種不同細胞的形態(tài)、大小及基本結構，了解細胞形態(tài)、大小與功能的關系；3初步掌握臨時制片和顯微鏡下的繪圖方法。,二、實驗原理,細胞是生物體的基本結構和功能單位。它們的形態(tài)多種多樣，并且其形態(tài)與功能是相適應的。細胞的大小差別很大，典型的原核細胞直徑平均在01～10ΜM之間，而真核細胞的直徑平均為3～30ΜM；一般來說，動植物細胞比細菌大10倍。同類型細胞的體積一般是相近的，不依生物個體的大小而增大或縮小。如人、牛、馬、鼠、象的腎細胞、肝細胞的大小基本相同。器官的大小主要決定于細胞的數(shù)量，與其成正比，而與細胞的大小無關，把這種現(xiàn)象為“細胞體積的守恒定律”,二、實驗原理,細胞是生物體的基本結構單位。構成生物機體的細胞是多種多樣的。要對細胞進行研究，首先要從其形態(tài)結構人手。所以，要借助顯微鏡的成像及放大原理，在顯微鏡下，才能觀察到細胞的基本形態(tài)結構。正確使用顯微鏡（低倍鏡→高倍鏡→油鏡）。,不同的細胞形態(tài),人類紅細胞,神經細胞,植物細胞的形態(tài)與大小,典型植物細胞的基本結構,,,不同類型細胞的形態(tài)結構存在很大的差異,不同類型細胞的形態(tài)結構存在很大的差異,,,典型的原核、真核、病毒和分子的大小,三、實驗材料和用品,實驗材料人口腔上皮細胞、洋蔥鱗莖表皮細胞。實驗試劑1碘液、9生理鹽水。實驗用品光學顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸管、擦鏡紙、吸水紙、紗布。,四、實驗步驟,1人口腔粘膜上皮細胞臨時標本的制備和觀察蓋玻片/載玻片的揩擦→涂片→標本的觀察2洋蔥鱗莖表皮細胞臨時標本的制備和觀察蓋玻片/載玻片的揩擦→標本的制備→標本的觀察,五、作業(yè),繪口腔上皮細胞、洋蔥鱗莖表皮細胞圖并注明各部分的結構名稱。,

簡介：發(fā)酵工程實驗指導THEEXPERIMENTALGUIDEFERMENTATIONENGINEERING,湖北理工學院化學與化工學院HTTP//CMEHBPUEDUCN/,啤酒發(fā)酵實驗,PART1麥芽汁糖度的測定及滅菌分裝,糖度的測定,麥芽汁的稀釋,具體工作,PART2啤酒酵母的擴大培養(yǎng)和主發(fā)酵,主發(fā)酵,PART3酒精度、實際濃度的測定,實驗步驟,PART4啤酒后發(fā)酵及品質評價,后發(fā)酵,品酒,THANKYOU,