dapt及阿霉素對人乳腺癌mda-mb-231細(xì)胞生物學(xué)活性的影響

1、DAPT及阿霉素對人乳腺癌MDAMB231細(xì)胞生物學(xué)活性的影響李志路，汪誠，楊亭，陳宸，劉勝春(400016重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科)［摘要］目的探討γ分泌酶抑制劑DAPT及阿霉素對人乳腺癌MDAMB231細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)MDAMB231細(xì)胞至對數(shù)期，隨機(jī)分為對照組、DAPT組、阿霉素組及聯(lián)合用藥組。藥物處理24h后，CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布和凋亡率，Wester

2、nBlot檢測Notch1，CyclinD1，PTEN和Bax蛋白的變化。結(jié)果DAPT對MDAMB231細(xì)胞的抑制呈劑量依賴性。與DAPT組或阿霉素組比較，聯(lián)合用藥組抑制作用更強(qiáng)，G1期和凋亡細(xì)胞比例更多(P0.05)，伴有Notch1和周期蛋白CyclinD1表達(dá)下降，抑癌基因PTEN和促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)(P0.05)。結(jié)論DAPT與阿霉素協(xié)同抑制人乳腺M(fèi)DAMB231細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。［關(guān)鍵詞］DAPT；阿霉素；MDAM

3、B231［中圖法分類號］R394.3R737.9R730.23［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］ADAPTenhancessensitivityofMDAMB231cellstodoxubicinLiZhiluWangChengYangTingChenChen(DepartmentofEndocrinetheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversityChongqing400016China)［Ab

4、stract］ObjectiveTodeterminedtheeffectofDAPTdoxubicinoncellviabilitycellcycleapoptosisofhumantriplenegativebreastcancerMDAMB231cells.MethodsMDAMB231cellsweretreatedwithDAPTdoxubicincombinationofboth.TheeffectofDAPTdoxubic

5、inoncellproliferationinvitrowastestedbyCCK8assay24hlater.Thecellapoptosiscellcyclewasdetectedbyflowcytometry.TheexpressionofNotch1BaxCyclinD1PTENproteinwasdetectedbyWesternBlot.ResultsMDAMB231cellsexhibitedgreatergrowthi

6、nhibitionapoptosiswithcombinationtherapythansingleagentDAPTFACSVantageSE購自BD公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1MDAMB231細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理MDAMB231在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，放置于37C、含5%CO2培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的MDAMB231細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板上。DMSO溶解DAPT，對照組加入等體積DMSO，DAPT組加入10

7、μMDAPT，阿霉素組加入10μgL阿霉素，聯(lián)合用藥組加入兩種藥物，DAPT先于阿霉素1h加入細(xì)胞中。培養(yǎng)液中DMSO終濃度小于0.1%。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h。每孔加入10μlCCK8溶液，2h后用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度A，細(xì)胞活性=用藥組A值對照組A值100%，加藥過程中避光操作。1.2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布取對數(shù)生長期MDAMB231細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板上，分組加藥方法同上。0.25%胰酶消化細(xì)胞，PBS漂洗

8、3次，75%冰乙醇固定過夜，1000rmin離心5min，棄乙醇，PBS漂洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度5105ml，加入1mlPI染液，4C孵育60min流式細(xì)胞儀檢測。1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞分組加藥同上，整細(xì)胞濃度5105ml，入5μlFITC標(biāo)記的AnnexinV，30min后加入500μlBuffer，混勻室溫避光反應(yīng)30min，流式細(xì)胞儀檢測。1.2.4細(xì)胞總蛋白提取細(xì)胞分組加藥同上，收集細(xì)胞沉淀。加入150250μl含有

9、蛋白酶抑制劑cocktail和PMSF的RIPA裂解液，吹打混勻，直至充分裂解，在12000g離心10min，吸取上清液。BCA法測定蛋白濃度，于80C保存?zhèn)溆茫胁僮骶诒线M(jìn)行。1.2.5Westernblot檢測細(xì)胞蛋白30μg蛋白加入上樣緩沖液100C煮沸10min，先以90V恒壓在5%SDSPAGE濃縮膠中電泳，樣品進(jìn)入10%SDSPAGE分離膠后再改為120V，至溴酚藍(lán)染料泳動(dòng)至距膠下緣1cm停止電泳。300mA恒流轉(zhuǎn)膜9