簡介:第17章核酸技術(shù),(一)重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)(二)重組DNA技術(shù)的基本操作過程(三)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用,,(一)重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ),重組DNA技術(shù)的定義,在體外,將一種外源DNA和載體DNA重新組合連接,形成雜交DNA,然后將其轉(zhuǎn)入宿主細胞,最終使外源DNA在宿主細胞中隨著宿主細胞的繁殖而增殖和表達,從而改變生物原有遺傳性狀的過程,稱為重組DNA技術(shù)。它是按生物科學(xué)規(guī)律,在體外人為的改造基因,最終往往使生物的遺傳性狀獲得改變,故又稱為“遺傳工程”,亦即“基因工程”。,1重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ),1重要的工具酶2載體,(1)重要的工具酶,它能夠識別、切割雙鏈DNA分子中的特定序列,這些特定序列多數(shù)為反向重復(fù)序列,一般長度是4、5或6BP。,①限制性內(nèi)切酶,①粘性末端如ECORI5’GAATTCCTTAAG3’②平齊末端如HAEIII5’GGCCCCGG3’,,,,,,,,,,②DNA連接酶,目前使用的連接酶有兩種大腸桿菌DNA連接酶黏性末端連接;T4連接酶黏性和平齊末端連接。,(2)載體,概念能將外源DNA帶入宿主細胞,進行復(fù)制擴增或最終使外源基因得以表達的自主DNA,稱為載體(VECTOR)。分類①克隆載體用于基因的復(fù)制、擴增、測序等;②表達載體用于目的基因的表達。,(二)重組DNA技術(shù)的基本操作過程,1目的基因的獲得2選擇和制備載體3將目的基因與載體進行切割連接4將重組體導(dǎo)入受體細胞5陽性克隆的篩選和鑒定6DNA重組體的擴增、表達等研究,,,重組DNA技術(shù)的基本操作過程,1目的基因的獲得,(1)提取DNA后,PCR體外特異擴增(2)以MRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成CDNA。(3)化學(xué)合成基因(4)限制性內(nèi)切酶從載體上切取(5)構(gòu)建基因文庫,調(diào)取目的基因,2載體的選擇和制備,原核生物常用的載體質(zhì)粒和噬菌體;真核生物常用的載體動物病毒、酵母;穿梭載體通常是指那些既能在真核細胞中繁殖又能在原核細胞中繁殖的載體。,,,目的基因與載體的酶切與連接,3,4重組DNA導(dǎo)入宿主細胞,大腸桿菌、酵母、真菌及各種真核細胞、受精卵細胞都可用于重組。,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)染,,5目的基因的篩選和鑒定,(1)遺傳學(xué)方法(2)核酸雜交法(3)PCR方法(4)酶切鑒定,,(1)遺傳學(xué)方法,利用載體的特殊標記如質(zhì)粒含有抗青霉素的基因,當(dāng)含外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可在含有青霉素的培養(yǎng)基中生長,而未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細菌在同樣的條件下不能生長。,(2)核酸雜交法,,菌落原位雜交,,,2,,,3,6,,2,,,,6,(3)多聚酶鏈式反應(yīng),20世紀80年代末發(fā)展起來的一種DNA特定片段體外快速合成擴增的方法,稱多聚酶鏈式反應(yīng)(POLYMERASECHAINREACTION,PCR)。PCR技術(shù)具有高度的靈敏性和特異性,能在極短的時間內(nèi)將目的基因擴增至數(shù)百萬倍,通過瓊脂糖凝膠電泳,可以直接觀察產(chǎn)物的存在。因此,PCR技術(shù)對于鑒定陽性克隆十分有效,而且無需制備DNA。,,,(4)酶切鑒定,,,目的基因表達,6,(三)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用,1DNA指紋技術(shù)2轉(zhuǎn)基因動物與動物克隆3基因診斷與基因治療,1DNA指紋技術(shù),DNA指紋DNAFINGERPRINT技術(shù)是20世紀70年代末發(fā)展起來的遺傳標記的方法。遺傳標記(GENETICMARKER)是指可用來區(qū)分不同群體或個體,又能穩(wěn)定遺傳的某些物質(zhì)。生物個體間的差異在本質(zhì)上是DNA的差異,因此DNA是最可靠的遺傳標記。,(1)限制性片段長度多態(tài)性,真核生物的DNA分子很長,在遺傳過程中DNA堿基由于替換、重排、插入、缺失等原因,在子代DNA中會引起差異形成多態(tài)性。當(dāng)用一種限制性內(nèi)切酶去切DNA時,DNA分子會降解成許多長短不等的片段,個體間這些片段是特異的,可以作為某一DNA(生物)的標記,將這種方法稱為限制性片段長度多態(tài)性(RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,RFLP)。,,,,個體1,個體2,在人體DNA文庫中發(fā)現(xiàn)的由9–70BP重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)排列而成的高變異區(qū),稱為小衛(wèi)星DNA(MINISATELLITEDNA)。不同個體的多態(tài)性來源于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)不同,同一家族小衛(wèi)星重復(fù)單位含有相同或相似的核心序列,用某一小衛(wèi)星DNA作探針,可與同一或不同物種多酶切DNA片段雜交,獲得DNA指紋圖譜(DNAFINGERPRINT)。所有真核生物基因組中還存在由26BP為重復(fù)單位的重復(fù)順序,因其重復(fù)單位比小衛(wèi)星短,稱為微衛(wèi)星DNA(MICROSATELLITEDNA)。,真核生物的小衛(wèi)星DNA,人的DNA指紋圖譜,,(2)隨機擴增多態(tài)性DNA,隨機擴增多態(tài)性DNA(RANDOMLYAMPLIFIEDPOLYMORPHICDNA,RAPD),又稱隨機引物PCR。是以9–10個核苷酸的隨機序列作引物,以基因組DNA為模板進行PCR擴增。產(chǎn)物電泳后紫外觀察,不同個體的圖帶差異明顯,如DNA指紋圖譜一樣。,,,,,個體1,個體2,2轉(zhuǎn)基因動物與動物克隆,(1)轉(zhuǎn)基因動物(2)體細胞克隆無性繁殖,,1982年,人們將大白鼠的生長激素基因放在質(zhì)粒中小白鼠金屬巰基蛋白啟動子之后。將重組好的這種質(zhì)粒,用特制的微量注射器注入小鼠受精卵的雄性原細胞核中,再將這個受精卵植入小鼠子宮中。,(1)轉(zhuǎn)基因動物,,啟動子,結(jié)果為發(fā)育成熟的小鼠體重比對照小鼠大兩倍,成為“碩鼠”或“超級鼠”。,1986年,美國制備出轉(zhuǎn)生長激素基因的豬。這種豬生長快,飼料轉(zhuǎn)換率和瘦肉率顯著提高而肥膘低,與注射生長激素的效果相同。我國現(xiàn)制備出轉(zhuǎn)基因豬、羊、兔等。然而,轉(zhuǎn)生長激素基因的豬生殖能力明顯下降,不能繁殖擴群。,,2019年7月世界第一例從成年動物體細胞,克隆出的哺乳動物綿羊“多利”誕生。2019年2月NATURE雜志報道將這個秘密向世人公布。,(2)體細胞克隆無性繁殖,克隆羊多利的產(chǎn)生過程,,多利羊之父威爾穆特教授英國愛丁堡羅斯林研究所,蘇格蘭胚胎學(xué)家。,2019年克隆批量化,美國克隆出50多只老鼠。日本克隆出8只完全一樣的小牛。,美國俄勒岡州沃爾小組成功克隆兩只恒河猴。,2000年人類的近親被克隆,克隆豬同年,幫助培育出多利羊的生物技術(shù)公司克隆出5只小豬仔,并宣稱克隆豬終將成為人類移植器官的“加工廠”,生產(chǎn)器官包括角膜、皮膚、腎、肝、肺、心臟等。珍稀瀕危動物的繁殖克隆大熊貓的實驗已開始報道。,2019年至今關(guān)于克隆人,關(guān)于克隆人的問題爭論的很激烈,在理論上,利用同樣方法,人可以克隆人,但各國至今還不允許克隆人。2019年,美、意科學(xué)家聯(lián)手展開克隆人體胚胎的工作。11月,美國科學(xué)家宣布首次克隆成功了處于早期階段的人類胚胎,稱其目標是為病人“定制”出不會誘發(fā)排異反應(yīng)的人體細胞用于移植。,2019年8月11日英國頒發(fā)全球首張“克隆人類胚胎”執(zhí)照,合法執(zhí)照有效期為一年,胚胎14天后必須毀壞,培育克隆嬰兒仍屬非法行為。研究目的①增加人類對自身胚胎發(fā)育的理解;②增加人類對高危疾病的認識和高危疾病治療方法的研究。,克隆動物存在的問題,克隆動物健康問題很多,世界各地的克隆動物流產(chǎn)、夭折、畸形現(xiàn)象非常嚴重。盡管現(xiàn)在關(guān)于克隆的爭論很多,但有一點是肯定的,那就是克隆技術(shù)遠不成熟,應(yīng)用克隆技術(shù)時需格外慎重。多利雖順利懷孕生子,但壽命短,2019年月2月15日,僅6歲半的多利羊死亡。,,3基因治療,是指在特定靶細胞的基因組中,插入外源基因或用外源基因置換異?;?,使細胞表達本來該基因不表達的產(chǎn)物,籍以補償或抑制異常表達的基因,達到治療疾病目的,稱為基因治療(GENETHERAPY)。,,,思考題,1簡述DNA重組技術(shù)的基本過程2基因工程載體包括哪些種類3獲得目的基因的方法有哪些4試述核酸鑒定與DNA重組技術(shù)的實際應(yīng)用。,
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