簡介：簡明生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)習(xí)指導(dǎo)與習(xí)題集簡明生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)習(xí)指導(dǎo)與習(xí)題集陳曉光陳曉光簡明生物化學(xué)與分子生物學(xué)（周慧主編）是教育部制藥工程專業(yè)教學(xué)指導(dǎo)分委員會組織編寫的高等學(xué)校制藥工程專業(yè)系列教材之一，全書由20章組成，分為四個部分第一部分從第一章至第五章，主要為生物大分子的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、酶、核酸、糖類和脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)；第二部分從第六章至第九章，主要為物質(zhì)代謝，介紹了蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂質(zhì)的分解與合成代謝；第三部分從第十章至第十五章，主要內(nèi)容是分子生物學(xué)，包括原核生物和真核生物染色體結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制、基因的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)生物合成機制與調(diào)節(jié)；第四部分從第十六章至第二十章，為分子生物學(xué)實驗方法，包括核酸的分離純化、基因重組技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)、核酸測序和核酸的分子雜交。為了幫助學(xué)生更好地理解和掌握教材，我們編寫了配套的學(xué)習(xí)指導(dǎo)用書。本學(xué)習(xí)指導(dǎo)與習(xí)題集在內(nèi)容上按教材編排章節(jié)順序編寫，每章內(nèi)容包括五個部分學(xué)習(xí)目標(biāo)、學(xué)習(xí)內(nèi)容綱要、學(xué)習(xí)要點、“習(xí)題練習(xí)”、“參考答案”組成?！皩W(xué)習(xí)目標(biāo)”以“掌握”、“熟悉”、“了解”三個不同層次要求學(xué)習(xí)每章內(nèi)容，加強理解，可作為教學(xué)大綱要求?！皩W(xué)習(xí)內(nèi)容綱要”簡要介紹每章學(xué)習(xí)內(nèi)容概要?！皩W(xué)習(xí)要點”概括介紹每章需要重點學(xué)習(xí)掌握的基本概念、主要內(nèi)容、相互聯(lián)系。包括一些生物大分子的分類，結(jié)構(gòu)特點，重要的理化性質(zhì)，酶學(xué)研究的動力學(xué)特征；重要的物質(zhì)代謝途徑，關(guān)鍵酶，代謝通路的生理意義；遺傳分子生物學(xué)中心法則，DNA、RNA、蛋白質(zhì)生物合成的各自體系組成及其功能，主要的合成過程及特點，基因重組操作的基本原理及過程等?！傲?xí)題練習(xí)”分為“選擇題”、“填空題”、“判斷題”、“名詞解釋”及“問答題”等多種形式，主要根據(jù)教材內(nèi)容、大綱要求進行設(shè)計，以幫助學(xué)生學(xué)習(xí)理解教材內(nèi)容，并有助于記憶。全部習(xí)題均有相應(yīng)“參考答案”，便于學(xué)習(xí)者復(fù)習(xí)或自學(xué)。本書適用于制藥工程專業(yè)本科生學(xué)習(xí)鞏固所學(xué)知識和考研復(fù)習(xí)，也可作為相關(guān)學(xué)科學(xué)生、教師的教學(xué)參考用書。緒論緒論一、生物化學(xué)的的概念一、生物化學(xué)的的概念生物化學(xué)生物化學(xué)（BIOCHEMISTRY是運用化學(xué)的理論和技術(shù)，研究生物體的物質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)、是運用化學(xué)的理論和技術(shù)，研究生物體的物質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)、物質(zhì)代謝與能量轉(zhuǎn)變，以及與生理功能之間關(guān)系的一門科學(xué)。物質(zhì)代謝與能量轉(zhuǎn)變，以及與生理功能之間關(guān)系的一門科學(xué)。生物化學(xué)（BIOCHEMISTRY，即生命的化學(xué)，是利用化學(xué)的原理與方法去探討生命的一門科學(xué)，是一門研究生物體的化學(xué)組成、體內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)和過程的學(xué)科。生物化學(xué)與分子生物學(xué)是藥學(xué)學(xué)科重要的理論基礎(chǔ)藥學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)是研究與藥學(xué)科學(xué)相關(guān)的生物化學(xué)與分子生物學(xué)理論、原理與技術(shù)及其在藥物研究、藥品生產(chǎn)、藥物質(zhì)量控制與臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)學(xué)科。它從分子水平研究生命現(xiàn)象本質(zhì)是研究疾病研究藥物治病原理不可缺少的基礎(chǔ)。生物化學(xué)與分子生物學(xué)理論及其技術(shù)的發(fā)展與現(xiàn)代藥學(xué)科學(xué)的發(fā)展具有越來越來密切的聯(lián)系，是中藥學(xué)的有效成分分離純化研究、藥物化學(xué)的新藥設(shè)計研究、藥理學(xué)的生化機理研究、生物藥劑學(xué)的代謝研究的重要理論基礎(chǔ)。生物化學(xué)與分子生物學(xué)的進展，為新藥的發(fā)現(xiàn)提供了理論、概念、技術(shù)和方法，使藥學(xué)科學(xué)步入一個新的發(fā)展階段，其特點是以化學(xué)模式為主體的藥學(xué)科學(xué)迅速轉(zhuǎn)向以生物學(xué)和化學(xué)相結(jié)合的新模式。因此生物化學(xué)與分子生物學(xué)在當(dāng)代藥學(xué)科學(xué)發(fā)展中起到了先導(dǎo)作用。生物化學(xué)與分子生物學(xué)在當(dāng)代制藥工業(yè)發(fā)展中起到了重要作用，以分子生物學(xué)DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的生物制藥工業(yè)開創(chuàng)了制藥工業(yè)一個新門類。作為制藥工程專業(yè)學(xué)生學(xué)習(xí)生物化學(xué)與分子生物學(xué)主要是學(xué)習(xí)與藥學(xué)相關(guān)較緊密領(lǐng)域的知識包括生物化學(xué)與分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論及技術(shù)為今后學(xué)習(xí)其它各有關(guān)藥學(xué)專業(yè)的課程奠定基礎(chǔ)。第一部分第一部分生物大分子生物大分子第一章第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo)1、掌握氨基酸和肽的基本結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。2、熟悉蛋白質(zhì)分離純化的方法及原理。3、了解蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定方法，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；生理活性肽。學(xué)習(xí)內(nèi)容綱要學(xué)習(xí)內(nèi)容綱要1、氨基酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)2、肽鍵3、生理活性肽4、蛋白質(zhì)分離和純化的方法及原理5、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能√學(xué)習(xí)要點學(xué)習(xí)要點第一節(jié)、氨基酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1氨基酸的概念氨基酸AMINOACID是蛋白質(zhì)分子的基本結(jié)構(gòu)單位。構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的氨基酸共有20種，這些氨基酸都是L構(gòu)型的Α氨基酸。2氨基酸分子的結(jié)構(gòu)通式3、氨基酸分類按帶電荷情況可分為三類①側(cè)鏈不帶電荷氨基酸非極性中性氨基酸8種（ALA、VAL、LEU、ILE、MET、PRO、PHE、TRP）；極性中性氨基酸7種（GLY、SER、THR、CYS、TYR、ASN、GLN）；②帶負(fù)電荷氨基酸2種（酸性氨基酸ASP、GLU）；

簡介：現(xiàn)代分子生物學(xué)MODERNMOLECULARBIOLOGY1現(xiàn)代分子生物學(xué)現(xiàn)代分子生物學(xué)復(fù)習(xí)提綱復(fù)習(xí)提綱第一章第一章緒論緒論第一節(jié)第一節(jié)分子生物學(xué)的基本含義及主要研究內(nèi)容分子生物學(xué)的基本含義及主要研究內(nèi)容1分子生物學(xué)MOLECULARBIOLOGY的基本含義廣義的分子生物學(xué)以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用為研究對象，從分子水平闡明生命現(xiàn)象和生物學(xué)規(guī)律。狹義的分子生物學(xué)偏重于核酸（基因）的分子生物學(xué)，主要研究基因或DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和調(diào)控等過程，也涉及與這些過程相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究。11分子生物學(xué)的三大原則1構(gòu)成生物大分子的單體是相同的2生物遺傳信息表達(dá)的中心法則相同3生物大分子單體的排列（核苷酸、氨基酸）的不同13分子生物學(xué)的研究內(nèi)容●DNA重組技術(shù)（基因工程）●基因的表達(dá)調(diào)控●生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能研究結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)）●基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究第二節(jié)第二節(jié)分子生物學(xué)發(fā)展簡史分子生物學(xué)發(fā)展簡史1準(zhǔn)備和醞釀階段時間19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初。確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。DNA是遺傳物質(zhì)的證明實驗一肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗DNA是遺傳物質(zhì)的證明實驗二噬菌體感染大腸桿菌實驗RNA也是重要的遺傳物質(zhì)煙草花葉病毒的感染和繁殖過程2建立和發(fā)展階段建立和發(fā)展階段1953年WATSON和CRICK的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑。主要進展包括遺傳信息傳遞中心法則的建立3發(fā)展階段發(fā)展階段基因工程技術(shù)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類深入認(rèn)識生命本質(zhì)并能動改造生命的新時期開始。第三節(jié)第三節(jié)分子生物學(xué)與其他學(xué)科的關(guān)系分子生物學(xué)與其他學(xué)科的關(guān)系思考思考證明DNA是遺傳物質(zhì)的實驗有哪些分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容。列舉5～10位獲諾貝爾獎的科學(xué)家，簡要說明其貢獻?，F(xiàn)代分子生物學(xué)MODERNMOLECULARBIOLOGY3斷裂基因，含有內(nèi)含子有大量順式作用元件（見第八章）存在大量的DNA多態(tài)性具有端粒結(jié)構(gòu)第二節(jié)第二節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)1DNA的一級結(jié)構(gòu)指四種核苷酸DAMP、DCMP、DGMP、DTMP按照一定的排列順序，通過磷酸二酯鍵連接形成的多核苷酸，也稱為堿基順序2DNA的二級結(jié)構(gòu)定義指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所產(chǎn)生的雙螺旋結(jié)構(gòu)。3DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點①脫氧核糖和磷酸通過3’5’磷酸二酯鍵交互連接，成為螺旋鏈的骨架。②堿基互補配對③螺旋參數(shù)螺旋直徑２NM。螺旋每旋轉(zhuǎn)一周10對堿基，每個堿基的旋轉(zhuǎn)角度為36；螺距34NM；堿基平面之間的距離為034NM。④大溝小溝大溝22NM小溝12NM4維持DNA雙螺旋的力氫鍵、堿基堆集力（包括疏水作用力和范德華力。）、磷酸基團間的靜電斥力、堿基分子內(nèi)能總之氫鍵和堿基堆集力有利于DNA維持雙螺旋結(jié)構(gòu)，而靜電斥力和堿基分子內(nèi)能則不利于DNA維持雙螺旋結(jié)構(gòu)。5雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本形式A，B，Z型雙螺旋ZDNA有什么生物學(xué)意義呢ZDNA在熱力學(xué)上是不利的。帶負(fù)電荷的磷酸根距離太近，產(chǎn)生靜電排斥。DNA鏈的局部不穩(wěn)定區(qū)的存在就成為潛在的解鏈位點。DNA解鏈?zhǔn)荄NA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程中必要的環(huán)節(jié)，因此ZDNA的結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。6DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)超螺旋的類型負(fù)超螺旋、松弛DNA、正超螺旋（轉(zhuǎn)化相關(guān)物質(zhì)拓?fù)洚悩?gòu)酶、溴化乙錠）超螺旋的意義①超螺旋形式是DNA分子復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的需要；②超螺旋可使DNA分子形成高度致密的狀態(tài)從而得以容納于有限的空間。7DNA的理化性質(zhì)變性和復(fù)性常用的變性方法熱變性、堿變性核酸變性程度的鑒定－紫外測定法第三節(jié)第三節(jié)DNA的復(fù)制概述的復(fù)制概述1DNA復(fù)制的基本機理－半保留復(fù)制DNA半保留復(fù)制的意義保證DNA代謝的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性是相對的，變異是絕對的2DNA復(fù)制的起點、方向和速度1起點復(fù)制子從復(fù)制原點（I）到終點，組成一個復(fù)制單位。原核生物只有一個復(fù)制子真核生物多個復(fù)制子2方向

簡介：_第一章第一章緒論緒論1染色體具有哪些作為遺傳物質(zhì)的特征染色體具有哪些作為遺傳物質(zhì)的特征答①分子結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定；②能夠自我復(fù)制，使親子代之間保持連續(xù)性；③能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制整個生命過程；④能夠產(chǎn)生可遺傳的變異。。2什么是核小體簡述其形成過程。什么是核小體簡述其形成過程。答由DNA和組蛋白組成的染色質(zhì)纖維細(xì)絲是許多核小體連成的念珠狀結(jié)構(gòu)。核小體是由H2AH2BH3H4各兩個分子生成的八聚體和由大約200BP的DNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體外面核小體的形成是染色體中DNA壓縮的第一階段。在核小體中DNA盤繞組蛋白八聚體核心，從而使分子收縮至原尺寸的17。200BPDNA完全舒展時長約68NM卻被壓縮在10NM的核小體中。核小體只是DNA壓縮的第一步。核小體長鏈200BP→核酸酶初步處理→核小體單體200BP→核酸酶繼續(xù)處理→核心顆粒146BP3簡述真核生物染色體的組成及組裝過程簡述真核生物染色體的組成及組裝過程答組成蛋白質(zhì)核酸。組裝過程1，首先組蛋白組成盤裝八聚體，DNA纏繞其上，成為核小體顆粒，兩個顆粒之間經(jīng)過DNA連接，形成外徑10NM的纖維狀串珠，稱為核小體串珠纖維；2，核小體串珠纖維在酶的作用下形成每圈6個核小體，外徑30NM的螺線管結(jié)構(gòu)；3，螺線管結(jié)構(gòu)再次螺旋化，形成超螺旋結(jié)構(gòu)；4，超螺線管，形成絆環(huán)，即線性的螺線管形成的放射狀環(huán)。絆環(huán)在非組蛋白上纏繞即形成了顯微鏡下可見的染色體結(jié)構(gòu)。4簡述簡述DNA的一的一二三級結(jié)構(gòu)的特征三級結(jié)構(gòu)的特征答DNA一級結(jié)構(gòu)4種核苷酸的的連接及排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)DNA二級結(jié)構(gòu)指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA三級結(jié)構(gòu)指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)6簡述簡述DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其在現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展中的意義雙螺旋結(jié)構(gòu)及其在現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展中的意義1DNA雙螺旋是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的多核苷酸的方向由核苷酸間的磷酸二酯鍵的走向決定，一條是53，另一條是35。（2）DNA雙螺旋中脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)（3）其兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結(jié)合，形成堿基對意義該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價值的是確認(rèn)了堿基配對原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是20世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。7DNA復(fù)制通常采取哪些方式復(fù)制通常采取哪些方式①線性DNA雙鏈的復(fù)制將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子在DNA末端形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)使分子沒有游離末端_龐大的轉(zhuǎn)座子（5000BP以上）TNA家族。12請說說插入序列與復(fù)合型轉(zhuǎn)座子之間異同。請說說插入序列與復(fù)合型轉(zhuǎn)座子之間異同。答轉(zhuǎn)座子是存在于染色體DNA上的可自主復(fù)制和位移的基本單位。最簡單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因而被稱為插入序列（IS），他們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。她常常被定位到特定的基團中，造成基因突變。、復(fù)合式轉(zhuǎn)座子是一類帶有某些抗藥性基因的轉(zhuǎn)座子，其兩翼是相同的或高度同源的IS序列，且IS序列是不能單獨移動的只能作為復(fù)合體移動而且IS序列也決定和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座能力。也是有沒有IS序列的轉(zhuǎn)座子TNA家族，其兩翼帶有38BP的倒置重復(fù)序列13組蛋白上都存在哪些修飾其作用是什么組蛋白上都存在哪些修飾其作用是什么P27答甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化等。以甲基化（基因激活與沉默）、乙?；ㄞD(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)錄延伸，DNA修復(fù)拼接復(fù)制，染色體組裝，基因沉默，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）為主。影響染色體的結(jié)構(gòu)和功能、基因的表達(dá)和沉默。第三章第三章生物信息的傳遞（上）生物信息的傳遞（上）從DNA到RNA1，什么是編碼鏈?zhǔn)裁词悄０骀?，什么是編碼鏈?zhǔn)裁词悄０骀湸鹋cMRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈（或有意義鏈）；另一條根據(jù)堿基互補原則指導(dǎo)MRNA合成DNA鏈稱為模版鏈（或反義鏈）。2，簡述，簡述RNARNA轉(zhuǎn)錄的概念及其基本過程。轉(zhuǎn)錄的概念及其基本過程。答RNA轉(zhuǎn)錄以DNA中的一條單鏈為模板，游離堿基為原料，在DNA依賴的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過程?；具^程模版識別轉(zhuǎn)錄開始轉(zhuǎn)錄延伸轉(zhuǎn)錄終止。3，大腸桿菌的，大腸桿菌的RNARNA聚合酶有哪些組成成分各個亞基的作用如何聚合酶有哪些組成成分各個亞基的作用如何答大腸桿菌的RNA聚合酶由2個Α亞基、一個Β亞基、一個Β’亞基和一個Ω亞基組成的核心酶，加上一個Σ亞基后則成為聚合酶全酶。Α亞基肯能與核心酶的組裝及啟動子的識別有關(guān)，并參與RNA聚合酶和部分調(diào)節(jié)因子的相互作用；Β亞基和Β’亞基組成了聚合酶的催化中心，Β亞基能與模版DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合。4，什么是封閉復(fù)合物、開放復(fù)合物以及三元復(fù)合物，什么是封閉復(fù)合物、開放復(fù)合物以及三元復(fù)合物答模版的識別階段，聚合酶與啟動子可逆性結(jié)合形成封閉性復(fù)合物；封閉性復(fù)合物形成后，此時，DNA鏈仍然處于雙鏈狀態(tài)，伴隨著DNA構(gòu)象的重大變化，封閉性復(fù)合物轉(zhuǎn)化為開放復(fù)合物；開放復(fù)合物與最初的兩個NTP相結(jié)合并在這兩個核苷酸之間形成磷酸二脂鍵后即轉(zhuǎn)變成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元復(fù)合物。5，簡述Σ因子的作用。，簡述Σ因子的作用。答1，Σ因子的作用是負(fù)責(zé)模版鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，它是酶的別構(gòu)效應(yīng)物，使酶專一性識別模版上的啟動子；2，Σ因子可以極大的提高RNA聚合酶對啟動子區(qū)DNA序列的親和力；3，Σ因子還能使RNA聚合酶與模版DNA上非特異性位點結(jié)合常數(shù)降低。6，什么是，什么是PRIBNOWPRIBNOWBOXBOX它的保守序列是什么它的保守序列是什么答PRIBNOWBOX是原核生物中中央大約位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游10BP處的TATA區(qū)，所以又稱作10區(qū)。它的保守序列是TATAAT。7，什么是上升突變什么是下降突變，什么是上升突變什么是下降突變

簡介：1分子生物學(xué)第二章第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能（核酸的結(jié)構(gòu)與功能（4學(xué)時）學(xué)時）基本要求基本要求了解核苷酸的結(jié)構(gòu)。熟悉核苷酸的命名。掌握核苷酸的化學(xué)組成。二、核酸的一級結(jié)構(gòu)二、核酸的一級結(jié)構(gòu)基本要點基本要點1DNA和RNA的一級結(jié)構(gòu)四種核苷酸或脫氧核苷酸按照一定的排列順序以3’，5’磷酸二酯鍵（PHOSPHODIESTERLINKAGE）相連形成的多聚核苷酸鏈或脫氧核苷酸（POLYDEOXYNUCLEOTIDES）稱為核苷酸序列也稱為堿基序列。脫氧核苷酸或核苷酸的連接具有嚴(yán)格的方向性，是前一核苷酸的３’OH與下一位核苷酸的5’位磷酸間形成3’，5’磷酸二酯鍵，構(gòu)成一個沒有分支的線性大分子。DNA的書寫應(yīng)從5到3。2RNA與DNA的差別戊糖成分是核糖不是脫氧核糖嘧啶為胞嘧啶和尿嘧啶而不含有胸腺嘧啶U代替了DNA的T。DNA和RNA對遺傳信息的攜帶和傳遞是依靠核苷酸中的堿基排列堿基排列順序變化順序變化而實現(xiàn)的?；靖拍罨靖拍詈怂岬囊患壗Y(jié)構(gòu)?；疽蠡疽笫煜NA與RNA的區(qū)別。掌握核酸的一級結(jié)構(gòu)。三、三、DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能的空間結(jié)構(gòu)與功能基本要點基本要點1DNA的二級結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型ＤＮＡ的雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景GAFF規(guī)則①腺嘌呤與胸腺嘧啶的摩爾數(shù)總是相等（ＡT），鳥嘌呤的含量總是與胞嘧啶相等（GC）；②不同生物種屬的DNA堿基組成不同，③同一個體不同器官、不同組織的DNA具有相同的堿基組成。ＤＮＡ雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點①ＤＮＡ是一反向平行的互補雙鏈結(jié)構(gòu)親水的脫氧核糖基和磷酸基骨架位于雙鏈的外側(cè)、而堿基位于內(nèi)側(cè)，兩條鏈的堿基互補配對，AT形成兩個氫鍵，GC形成三個氫鍵。堆積的疏水性堿基平面與線性分子結(jié)構(gòu)的長軸相垂直。兩條鏈呈反平行走向，一條鏈５’→３’，另一條鏈?zhǔn)牵场怠?。）?②在真核MRNA的3末端有一多聚腺苷酸POLYA結(jié)構(gòu)通常稱為多聚A尾。一般由數(shù)十個至一百幾十個腺苷酸連接而成。POLYA是RNA生成后加上去的。POLYA與MRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及MRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。各種MRNA的長短差別很大MRNA分子的長短決定翻譯的蛋白質(zhì)分子量的大小。各種RNA分子中MRNA的半衰期最短由幾分鐘到數(shù)小時不等是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速度的調(diào)控點之一。MRNA的功能是把核內(nèi)DNA的堿基順序遺傳信息按照堿基互補的原則抄錄并轉(zhuǎn)送至胞質(zhì)在蛋白質(zhì)合成中用以翻譯成蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。MRNA分子上每3個核苷酸為一組三聯(lián)體密碼TRIPLETCODE。2轉(zhuǎn)運RNA的結(jié)構(gòu)與功能轉(zhuǎn)運RNATRANSFERRNATRNA是細(xì)胞內(nèi)分子量最小的一類核酸100多種TRNA都由70至90個核苷酸構(gòu)成。TRNA的功能是在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成過程中作為各種氨基酸的載體并將其轉(zhuǎn)呈給MRNA。TRNA的結(jié)構(gòu)特點①分子中含1020的稀有堿基RAREBASES。稀有堿基是指除A、G、C、U外的一些堿基包括雙氫尿嘧啶DHU、假尿嘧啶ΨPSEUDOURIDINE和甲基化的嘌呤MGMA等圖312。一般的嘧啶核苷以雜環(huán)上N1與糖環(huán)的C1’連成糖苷鍵假尿嘧啶核苷則用雜環(huán)上的C5與糖環(huán)的C1’相連。②TRNA核苷酸中存在局部互補配對的區(qū)域可以形成局部雙鏈進而形成一種莖環(huán)樣STEMLOOP結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。中間不能配對的部分則膨出形成環(huán)狀或襻狀。TRNA形成三葉草形CLOVERLEAFPATTERN二級結(jié)構(gòu)。分別稱為DHU環(huán)和TΨ環(huán)以及反密碼環(huán)。反密碼子ANTICODEN與MRNA相應(yīng)的三聯(lián)體密碼子堿基互補。例如負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運酪氨酸的TRNATRNATYR的反密碼子5GUA3與MRNA上相應(yīng)的三聯(lián)體密碼子5UAC3編碼酪氨酸呈反向互補。不同的TRNA依照其轉(zhuǎn)運的氨基酸的差別有不同的反密碼子。X射線衍射結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)TRNA的共同三級結(jié)構(gòu)是倒L型圖313B。倒L形三級結(jié)構(gòu)中TΨ環(huán)與DHU環(huán)相距很近。3核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能核蛋白體RNARIBOSOMALRNARRNA約占RNA總量的80以上。RRNA與核蛋白體蛋白共同構(gòu)成核蛋白體或稱為核糖體RIBOSOME原核生物和真核生物的核蛋白體均由易于解聚的大、小兩個亞基組成。真核生物的核蛋白體小亞基由18SRRNA及30余種蛋白質(zhì)構(gòu)成；大亞基則由5S、58S、及28S三種RRNA加上近50種蛋白質(zhì)構(gòu)成表33。真核生物的18SRRNA的二級結(jié)構(gòu)呈花狀圖314形似40S小亞基其中多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)為核蛋白體蛋白的結(jié)合和組裝提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。DNA復(fù)性復(fù)性變性DNA在適當(dāng)條件下，分開的兩條單鏈分子按照堿基互補原則重新恢復(fù)天然

簡介：填空題填空題1、分子生物學(xué)研究內(nèi)容主要包括以下四個方面DNA重組技術(shù)、基因表達(dá)調(diào)控研究基因組、功能基因組與生物信息學(xué)和生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究2、原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，只有很少數(shù)基因是以多拷貝形式存在，整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成。3、核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個分子生成的八聚體和由大約200BPDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。4、錯配修復(fù)系統(tǒng)根據(jù)“保存母鏈，修正子鏈”的原則，找出錯誤堿基所在的DNA鏈，進行修復(fù)。5、基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個階段，轉(zhuǎn)錄階段是基因表達(dá)的核心步驟，翻譯是基因表達(dá)的最終目的。6、–10位的TATA區(qū)和–35位的TTGACA區(qū)是RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合位點，能與Σ因子相互識別而具有很高的親和力。7、核糖體小亞基負(fù)責(zé)對模板MRNA進行序列特異性識別，大亞基負(fù)責(zé)攜帶氨基酸及TRNA的功能8、DNA后隨鏈合成的起始要一段短的__RNA引物___，它是由__DNA引發(fā)酶_以核糖核苷酸為底物合成的。9、幫助DNA解旋的___單鏈DNA結(jié)合蛋白____與單鏈DNA結(jié)合，使堿基仍可參與模板反應(yīng)。10、真核生物的MRNA加工過程中5’端加上_帽子結(jié)構(gòu)__，在3’端加上_多腺苷化尾___，后者由__POLYA聚合酶_催化。如果被轉(zhuǎn)錄基因是不連續(xù)的，那么，_內(nèi)含子__一定要被切除，并通過_剪接___過程將__外顯子__連接在一起。這個過程涉及很多RNA分子，如U1和U2等，它們被統(tǒng)稱為_SNRNA___。它們分別與一組蛋白質(zhì)結(jié)合形成__SNRNP__，并進一步地組成40S或60S的結(jié)構(gòu)，叫___剪接體___。二、選擇題二、選擇題1、C2、A3、D4、B5、B6、ACE7、C8、BC9、AC10、CD1、證明DNA是遺傳物質(zhì)的兩個關(guān)鍵性實驗是肺炎鏈球菌在老鼠體內(nèi)的毒性和T2噬菌體感染大腸桿菌。這兩個實驗中主要的論點證據(jù)是（C）A從被感染的生物體內(nèi)重新分離得到DNA，作為疾病的致病劑BDNA突變導(dǎo)致毒性喪失C生物體吸收的外源DNA（而并非蛋白質(zhì)）改變了其遺傳潛能DDNA是不能在生物體間轉(zhuǎn)移的，因此它一定是一種非常保守的分子2、1953年WATSON和CRICK提出（A）（A）多核苷酸DNA鏈通過氫鍵連接成一個雙螺旋（B）DNA的復(fù)制是半保留的，常常形成親本子代雙螺旋雜合鏈（C）三個連續(xù)的核苷酸代表一個遺傳密碼（D）遺傳物質(zhì)通常是DNA而非RNA3、原核細(xì)胞信使RNA含有幾個功能所必需的特征區(qū)段，它們是（D）（A）啟動子，SD序列，起始密碼子，終止密碼子，莖環(huán)結(jié)構(gòu)（B）啟動子，轉(zhuǎn)錄起始位點，前導(dǎo)序列，由順反子間區(qū)序列隔開的SD序列和F，尾部序列，莖環(huán)結(jié)構(gòu)（C）轉(zhuǎn)錄起始位點，尾部序列，由順反子間區(qū)序列隔開的SD序列和F，莖環(huán)結(jié)構(gòu)（D）轉(zhuǎn)錄起始位點，前導(dǎo)序列，由順反子間區(qū)序列隔開的SD序列和F，尾部序列4、下面哪一項是對三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的正確描述（B）（A）Σ因子、核心酶和雙鏈DNA在啟動子形成的復(fù)合物（B）全酶、模板DNA和新生RNA形成的復(fù)合物（C）三個全酶在轉(zhuǎn)錄起始點形成的復(fù)合物（D）Σ因子、核心酶和促旋酶形成的復(fù)合物5、色氨酸操縱子的調(diào)控作用是受兩個相互獨立的系統(tǒng)控制的，其中一個需要前導(dǎo)肽的翻譯，下面哪一個調(diào)控這個系統(tǒng)（B）（A）色氨酸（B）色氨酰TRNATRP（C）色氨酰TRNA（D）CAMP二）多選題6、DNA的變性（ACE）（A）包括雙螺旋的解鏈B）可以由低溫產(chǎn)生（C）是可逆的（D）是磷酸二酯鍵的斷裂（E）包括氫鍵的斷裂7、DNA在30NM纖絲中壓縮多少倍（C）（A）6倍（B）10倍（C）40倍（D）240倍降解RNA引物并由DNA聚合酶I將缺口補齊，再由DNA連接酶將兩個岡崎片段連在一起形成大分子DNA。3、轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)。、轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)。①轉(zhuǎn)座引起插入突變。②轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因。③轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變。④轉(zhuǎn)座引起的生物進化。4、Σ因子的作用。、Σ因子的作用。Α亞基可能與核心酶的組裝及啟動子識別有關(guān)，并參與RNA聚合酶和部分調(diào)節(jié)因子的相互作用。Σ因子可以極大地提高RNA聚合酶對啟動子區(qū)DNA序列的親和力。Σ因子的作用是負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，它是酶的別構(gòu)效應(yīng)物，使酶專一性識別模板上的啟動子。Σ因子不僅增加聚合酶對啟動子的親和力，還降低了它對非專一位點的親和力。5、原核與真核生物、原核與真核生物MRNAMRNA的特征比較。的特征比較。原核生物MRNA的特征1半衰期短。2許多原核生物MRNA以多順反子的形式存在。3原核生物MRNA的5’端無帽子結(jié)構(gòu)，3’端沒有或只有較短的多聚（A）結(jié)構(gòu)。真核生物MRNA的特征1真核生物MRNA的5’端存在“帽子”結(jié)構(gòu)。2絕大多數(shù)真核生物MRNA具有多聚A尾巴。6、I類內(nèi)含子的自我剪切過程。類內(nèi)含子的自我剪切過程。在I類內(nèi)含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的3’OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，從上游切開RNA鏈。再由上游外顯子的自由3’OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開，上下游兩個外顯子通過新的磷酸二酯鍵相連。7、SANGERSANGER雙脫氧鏈終止法。雙脫氧鏈終止法。英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實驗室的FSANGER等人于1977年發(fā)明了利用DNA聚合酶的雙脫氧鏈終止原理測定核苷酸序列的方法。由于這種方法要求使用一種單鏈DNA模板和一種適當(dāng)?shù)腄NA引物，因此有時也稱為引物合成法或酶催引物合成法。它利用了DNA聚合酶所具有的兩種酶催反應(yīng)的特性第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA作模板，合成出準(zhǔn)確的DNA互補鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2，3雙脫氧核苷三磷酸作底物，將其摻入到寡核苷酸鏈的3末端，從而終止DNA鏈的生長。9、假定你從一新發(fā)現(xiàn)的病毒中提取了核酸。請用最簡單的方法確定、假定你從一新發(fā)現(xiàn)的病毒中提取了核酸。請用最簡單的方法確定1）它是DNA還是RNA（2）它是單鏈還是雙鏈確定堿基比率。如果有胸腺嘧啶，為DNA，如果有尿嘧啶，則為RNA。如果為雙鏈分子，那么A與T（或U）的量以及G或C的量應(yīng)相等。1010、熱激蛋白調(diào)控的基因表達(dá)機制。、熱激蛋白調(diào)控的基因表達(dá)機制。許多生物在最適溫度范圍以上，能受熱誘導(dǎo)合成一系列熱休克蛋白（HEATSHOCKPROTEIN）。受熱后，果蠅細(xì)胞內(nèi)HSP70MRNA水平提高1000倍，就是因為熱激因子（HEATSHOCKFACT，HSF）與HSP70基因TATA區(qū)上游60BP處的HSE相結(jié)合，誘發(fā)轉(zhuǎn)錄起始。在沒有受熱或其他環(huán)境脅迫時，HSF主要以單體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)。單體HSF沒有DNA結(jié)合能力，HSP70可能參與了維持HSF的單體形式。受到熱激或其他環(huán)境脅迫時，細(xì)胞內(nèi)變性蛋白增多，它們都與HSF競爭結(jié)合HSP70，從而釋放HSF，使之形成三體并輸入核內(nèi)。HSF一旦形成三體，便擁有與HSE特異結(jié)合、促進基因轉(zhuǎn)錄的功能。這種能力可能還受磷酸化水平的影響，因為熱激以后，HSF不但形成三體，還會迅速被磷酸化。HSF與HSE的特異性結(jié)合，引起包括HSP70在內(nèi)的許多熱激應(yīng)答基因表達(dá)，大量產(chǎn)生HSP70蛋白。隨著熱激溫度消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量游離的HSP70蛋白，它們與HSF相結(jié)合，形成沒有DNA結(jié)合能力的單體并脫離DNA。六、問答題六、問答題1、描述蛋白質(zhì)的生物合成過程、描述蛋白質(zhì)的生物合成過程。要點蛋白質(zhì)的生物合成是一個比DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄更為復(fù)雜的過程。它包括①翻譯的起始核糖體與MRNA結(jié)合并與氨基酰TRNA生成起始復(fù)合物。②肽鏈的延伸由于核糖體沿MRNA5端向3端移動，開始了從N端向C端的多肽合成，這是蛋白質(zhì)合成過程中速度最快的階段。③肽鏈的終止及釋放。核糖體從MRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)。2、比較原核生物和真核生物基因調(diào)控的異同點。、比較原核生物和真核生物基因調(diào)控的異同點。1、轉(zhuǎn)錄因子是與稱之效應(yīng)成分的特殊的DNA序列相互作用的DNA結(jié)合蛋白，效應(yīng)成分位于基因的調(diào)節(jié)區(qū)或啟動

簡介：1一、選擇題單選或多選1證明DNA是遺傳物質(zhì)的兩個關(guān)鍵性實驗是肺炎球菌在老鼠體內(nèi)的毒性和T2噬菌體感染大腸桿菌。這兩個實驗中主要的論點證據(jù)是A從被感染的生物體內(nèi)重新分離得到DNA，作為疾病的致病劑BDNA突變導(dǎo)致毒性喪失C生物體吸收的外源DNA而并非蛋白質(zhì)改變了其遺傳潛能DDNA是不能在生物體間轉(zhuǎn)移的，因此它一定是一種非常保守的分子E真核生物、原核生物、病毒的DNA能相互混合并彼此替代21953年WATSON和CRICK提出A多核營酸DNA鏈通過氫鍵連接成一個雙螺旋BDNA的復(fù)制是半保留的，常常形成親本子代雙螺旋雜合鏈C三個連續(xù)的核苷酸代表一個遺傳密碼D遺傳物質(zhì)通常是DNA而非RNAE分離到回復(fù)突變體證明這一突變并非是一個缺失突變3雙鏈DNA中的堿基對有AAUBGTCCGDTAECA4DNA雙螺旋的解鏈或變性打斷了互補堿基間的氫鍵，并因此改變了它們的光吸收特性。以下哪些是對DNA的解鏈溫度的正確描述A哺乳動物DNA約為45℃，因此發(fā)燒時體溫高于42℃是十分危險的B依賴于AT含量，因為AT含量越高則雙鏈分開所需要的能量越少C是雙鏈DNA中兩條單鏈分開過程中溫度變化范圍的中間值D可通過堿基在260MM的特征吸收峰的改變來確定E就是單鏈發(fā)生斷裂磷酸二酯鍵斷裂時的溫度5DNA的變性A包括雙螺旋的解鏈B可以由低溫產(chǎn)生C是可逆的D是磷酸二酯鍵的斷裂E包括氫鍵的斷裂6在類似RNA這樣的單鏈核酸所表現(xiàn)出的“二級結(jié)構(gòu)”中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成（）A基于各個片段間的互補，形成反向平行雙螺旋B依賴于AU含量，因為形成的氫鍵越少則發(fā)生堿基配對所需的能量也越少C僅僅當(dāng)兩配對區(qū)段中所有的堿基均互補時才會發(fā)生D同樣包括有像GU這樣的不規(guī)則堿基配對E允許存在幾個只有提供過量的自由能才能形成堿基對的堿基7DNA分子中的超螺旋3DNA或RNA但不可能同時兼有，因此DNA不是完全通用的遺傳物質(zhì)。5COT1／2與基因組大小相關(guān)。6C0C12與基因組復(fù)雜性相關(guān)。7非組蛋白染色體蛋白負(fù)責(zé)30NM纖絲高度有序的壓縮。三、簡答題1堿基對間在生化和信息方面有什么區(qū)別2在何種情況下有可能預(yù)測某一給定的核苷酸鏈中“G”的百分含量3真核基因組的哪些參數(shù)影響COT1／2值4請問哪些條件可促使DNA復(fù)性退火5為什么DNA雙螺旋中維持特定的溝很重要6大腸桿菌染色體的分子量大約是25109DA1，核苷酸的平均分子量是330DA，兩個鄰近核苷酸對之間的距離是034MN；雙螺旋每一轉(zhuǎn)的高度即螺距是34NM，請問L該分子有多長2該DNA有多少轉(zhuǎn)7曾經(jīng)有一段時間認(rèn)為，DNA無論來源如何，都是4個核甘酸的規(guī)則重復(fù)排列如，ATCGATCGATCGATCG，所以DNA缺乏作為遺傳物質(zhì)的特異性。第一個直接推翻該四核苷酸定理的證據(jù)是什么8為什么在DNA中通常只發(fā)現(xiàn)AT和CG堿基配對9列出最先證實是DNA或RNA而不是蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì)的一些證據(jù)。10為什么只有DNA適合作為遺傳物質(zhì)LL什么是連鎖群舉一個屬于連鎖基因座的例子。12什么是順反子用“互補”和“等位基因”說明“基因”這個概念。四、實驗設(shè)計與分析1假定你在25℃條件下用如下濃度的DNASEI0，01，10及100MG／ML，對雞紅細(xì)胞細(xì)胞核的染色質(zhì)進行酶切20分鐘。將這些樣品與分子量標(biāo)記一起上樣于6％變性聚丙烯酚胺凝膠，下圖是凝膠電泳的結(jié)果。但由于你混淆了樣品，因此弄不清每個泳道對應(yīng)的樣品是什么。惟一可以確信的是分子量標(biāo)記上樣于左邊的泳道，但忘記了各帶對應(yīng)的分子量大小圖11。L請回憶起在各泳道分別使用的是哪一濃度的DNASEI2請指出分子量標(biāo)記泳道用M表示各帶的大約分子量。3描述各泳道所顯示的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，證實所記憶的數(shù)字是正確的。

簡介：生物奧賽輔導(dǎo)專項練習(xí)下列哪項改變不影響酶催化反應(yīng)的最初線性速率（E）A、底物濃度B、酶濃度C、PHD、溫度E、時間酶的KM值大小與（A）A、酶性質(zhì)有關(guān)B、酶濃度有關(guān)C、酶作用溫度有關(guān)D、酶作用時間有關(guān)E、以上均有關(guān)有關(guān)別構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)特點，哪一項不正確（D）A、有多個亞基B、有與底物結(jié)合的部位C、有與調(diào)節(jié)物結(jié)合的部位D、催化部位與別構(gòu)部位都位于同一亞基上E、催化部位與別構(gòu)部位既可以處于同一亞基也可以處于不同亞基上下列哪一種酶的輔酶不含維生素（D）A、谷草轉(zhuǎn)氨酶B、琥珀酸脫氫酶C、乳酸脫氫酶D、糖原合成酶E、丙酮酸脫氫酶生物奧賽輔導(dǎo)專項練習(xí)5、屬于亞氨基酸的是（B）。A、組氨酸B、脯氨酸C、精氨酸D、賴氨酸E、蛋白質(zhì)6、哪一種蛋白質(zhì)組分在280NM處，具有最大的光吸收（A）A、色氨酸的吲哚環(huán)B、酪氨酸的苯酚基C、苯丙氨酸苯環(huán)D、半胱氨酸的巰基E、肽鏈中的肽鍵7、有一混合蛋白質(zhì)溶液，其PI值分別為4650536773，電泳時欲使其中四種泳向正極，緩沖液PH應(yīng)該是多少DA、40B、50C、60D、70E、808、與茚三酮反應(yīng)呈黃色的氨基酸是（E）。A、苯丙氨酸B、酪氨酸C、色氨酸D、組氨酸E、脯氨酸9、維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是（D）。A、鹽鍵B、疏水鍵C、二硫鍵D、氫鍵E、范德華力10、下列哪種方法可用于測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量（A）A、SDS聚丙烯酰胺凝胸電泳法B、280260NM紫外吸

簡介：分子生物學(xué)入學(xué)考試大綱分子生物學(xué)入學(xué)考試大綱一、考試說明要求考生對分子生物學(xué)的含義概念、發(fā)展歷史、研究內(nèi)容等知識有較深入的了解，掌握核酸和蛋白質(zhì)大分子的基本結(jié)構(gòu)、功能和理化特性，熟練掌握基因結(jié)構(gòu)與功能、原核生物與真核生物DNA復(fù)制、DNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、基因表達(dá)調(diào)控等基本原理和基本概念，以及PCR克窿、分子標(biāo)記、基因重組等技術(shù)。1參考教材現(xiàn)代分子生物學(xué)（第三版），朱玉賢、李毅，北京高等教育出版社，2007。英漢對照分子生物學(xué)導(dǎo)論，王勇，北京化工出版社，2008WEAVERRFMOLECULARBIOLOGYSECONDEDITION北京科學(xué)出版社2002MALACINSKIGMFREITELDERDESSENTIALSOFMOLECULARBIOLOGYTHIRDEDITION北京科學(xué)出版社20022題型及分?jǐn)?shù)比例名詞解釋（20）、選擇（20）、判斷（20）、問答題（40），共計100分。二、考試內(nèi)容（一）核酸的結(jié)構(gòu)與功能1DNA結(jié)構(gòu)與功能2RNA結(jié)構(gòu)與功能（二）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（三）基因與基因組1基因的概念與結(jié)構(gòu)2基因組（四）DNA的復(fù)制1DNA復(fù)制的基本方式2DNA生物合成過程（五）RNA的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工1轉(zhuǎn)錄過程2真核生物轉(zhuǎn)錄后修飾（七）蛋白質(zhì)的生物合成1蛋白質(zhì)生物合成過程2蛋白質(zhì)合成后加工和輸送（八）基因的表達(dá)調(diào)控1基本概念和原理2原核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)3真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)（九）分子標(biāo)記技術(shù)1以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)2以PCR反應(yīng)為核心的分子標(biāo)記3新型分子標(biāo)記（十）DNA重組技術(shù)1DNA重組技術(shù)相關(guān)概念及意義2DNA重組技術(shù)的原理及過程（十一）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)1PCR反應(yīng)體系和過程2常用的PCR技術(shù)3PCR的主要用途

簡介：芝麻種質(zhì)資源及相關(guān)分子生物學(xué)研究進展芝麻種質(zhì)資源及相關(guān)分子生物學(xué)研究進展宮慧慧，趙逢濤，裴偉，孟慶華（山東棉花研究中心，濟南250100）摘要摘要芝麻是重要的優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)油料作物，素有“油料皇后”的美稱。我國擁有豐富的芝麻種質(zhì)資源，深入研究、評價和有效利用芝麻種質(zhì)資源是保護其遺傳多樣性、拓寬遺傳基礎(chǔ)進而提高芝麻產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵。本文對芝麻種質(zhì)資源的收集保存、鑒定評價與利用現(xiàn)狀、品種選育概況及相關(guān)分子生物學(xué)研究進展進行綜述，期望能對芝麻遺傳及應(yīng)用研究提供一些參考。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞芝麻；種質(zhì)資源；分子生物學(xué)；研究進展ADVANCESINSESAMESESAMUMINDICUMLGERMPLASMRESOURCESMOLECULARBIOLOGYRESEARCHGONGHUIHUIZHAOFENGTAOPEIWEIMENGQINGHUASHONGCOTTONRRESEARCHCENTERJI’′NAN250100ABSTRACTSESAMEANIMPTANTTRADITIONALOILCROPISKNOWNASTHEQUEENOFOILCROPSMEMBEROFTHEPEDALIACEAEFAMILYISCONSIDEREDASTHEQUEENOFOILSEEDSFITSHIGHOILCONTENTQUALITYCHINAHASRICHAWEALTHOFSESAMEGERMPLASMRESOURCESINDEPTHSTUDYEFFECTIVERESEARCHEVALUATIONUTILIZATIONOFVARIOUSSESAMEPLANTGERMPLASMRESOURCESISOFVITALIMPTANCETOPROTECTTHEITSGEICDIVERSITYTOBROADENTHEGEICBASISTOIMPROVECROPSESAMEYIELDSQUALITYTHISPAPERREVIEWEDTHELATESTPROGRESSESOFSESAMEGERMPLASMRESEARCHSUCHASGERMPLASMCOLLECTIONCONSERVATIONUTILIZATIONVARIETYBREEDINGMOLECULARGEICSFUNCTIONALGENOMICSWEHOPETHISPAPERCANPROMOTESESAMEHELPINTHEGEICAPPLICATIONSTUDYOFSESAMEKEYWDSSESAMEGERMPLASMRESOURCESRESEARCHPROGRESS芝麻（SESAMUMINDICUML2N26）別名胡麻，是唇形目胡麻科胡麻屬的一個栽培種，基因組較小，約為369MB11。芝麻是世界上最古老的油料作物之一，具有很高的營養(yǎng)價值，種子含油量高達(dá)50～60，其中不飽和脂肪酸含量（油酸和亞油酸）超過80；，蛋白質(zhì)含量為20～30；，且富含各種糖類、維生素、礦物質(zhì)、卵磷脂和芝麻酚、芝麻素、維生素E等天然抗氧化類物質(zhì)2，是廣受歡迎的醫(yī)食兩用作物。芝麻起源于南亞，廣泛分布于南、北緯40以內(nèi)的熱帶和溫帶地區(qū)3。全球常年種植面積約為780萬HM2，其中亞洲占632，非洲占324，美洲約占44。全球年產(chǎn)量約為308萬噸T，其中緬甸、印度、中國、蘇丹和埃塞俄比亞是其主產(chǎn)國，其年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)的66。我國芝麻常年種植面積在70萬HM2左右，產(chǎn)量約為624萬噸T，僅次于緬甸（89萬噸T）和印度（636萬T噸），在國際芝麻產(chǎn)業(yè)中占有重要地位2013UNFOODAGRICULTUREGANIZATION統(tǒng)計。河南、安徽、湖北和江西是全國主產(chǎn)省COMMENTEDC1第一外審專家曾提到修改題目，是否修改請說明。進一步通讀全文，通順語句，注意標(biāo)點符合的運用。老師題目是按照第一審稿專家的建議修改的芝麻育種的親本合理高效組配及分子生物學(xué)研究提供了便捷。13芝麻種質(zhì)資源在育種中的利用種質(zhì)資源研究的最終目的是促進它在遺傳育種中的利應(yīng)用。我國芝麻品種的遺傳改良始于20世紀(jì)50年代。，在長期的系統(tǒng)選育和雜交育種過程中，一批優(yōu)良品種資源（如河北霸王鞭、上蔡紫花葉二三、南陽八大杈、武寧黑、宜陽白）和一些國外品種等被鑒定、篩選出來，并不斷地應(yīng)用到后續(xù)親本組配中，在育種中發(fā)揮了重要作用。到目前為止，已有100多個芝麻品種通過審（認(rèn)）定，在過去的幾十年里，它們均不同程度地解決了芝麻生產(chǎn)發(fā)展中的問題。然而隨著我國芝麻單產(chǎn)水平不斷提高，骨干親本的頻繁使用和輪回選擇等導(dǎo)致我國芝麻推廣品種遺傳基礎(chǔ)日益狹窄、多樣性偏低已有共識。YXZHANG22、KWU23等通過系譜研究發(fā)現(xiàn)，中國大面積推廣的品種均可追溯到宜陽白、中芝7號、武寧黑、豫芝4號等少數(shù)幾個品種；YXZHANG22等對中國芝麻主產(chǎn)區(qū)19502007年間應(yīng)用的67個主栽品種的遺傳演變趨勢進行分析，證實19902007年間品種的遺傳基礎(chǔ)較19501969年間和19701989年間的窄，遺傳多樣性呈下降趨勢；KWU23同樣發(fā)現(xiàn)人工選擇和遺傳漂移使中國芝麻選育品種遺傳多樣性低于地方品種。因此，在育種過程中豐富品種遺傳背景、提高遺傳多樣性對我國芝麻生產(chǎn)十分重要。14芝麻相關(guān)野生種的收集與研究利用野生種芝麻保留了的很多有利基因，是拓寬栽培種遺傳基礎(chǔ)，進行遺傳改良、拓寬遺傳基礎(chǔ)的重要基因來源。我國保存有野芝1號（SESAMUMRADIATUMSCHUM＆THONN）和剛果野芝麻（SESAMUMSCHINZIANUMH）2個野生種芝麻。張海洋等24研究發(fā)現(xiàn)，野生種（2N64）的染色體核型為1A和1B，屬對稱類型，是胡麻屬中較為原始的物種，種間進化關(guān)系比較明確；核型似近系數(shù)聚類結(jié)果顯示，野生種與栽培種之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。芝麻的種間雜交F1株系顯示出高抗枯萎病特性，在株高、根結(jié)構(gòu)及籽子粒體積等方面表現(xiàn)出超親優(yōu)勢，因此開展芝麻遠(yuǎn)緣雜交對提高品種抗性并充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢具有重要意義。但是，野生種與栽培種具有雜交不親和性，通過胚培養(yǎng)技術(shù)可成功獲得種間雜交后代2526。2芝麻相關(guān)分子生物學(xué)研究概述芝麻分子生物學(xué)研究起步相對較晚，但最近幾年發(fā)展迅速，已在分子標(biāo)記開發(fā)、高密度遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因發(fā)掘與定位、功能基因克隆與驗證、全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組解析等方面取得了重要進展。21基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源遺傳背景評價的重要途徑。目前，大量的常用分子標(biāo)記如RAPD、AFLP、SRAP、ISSR、SSR等被應(yīng)用到芝麻遺傳背景差異分析中112728。ONBENSON29等利用ISSR標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)東非地方品種和野生種的遺傳多樣性指數(shù)和SHANNON’′S指數(shù)分別是028和034，遺

簡介：分子生物學(xué)課程教學(xué)大綱分子生物學(xué)課程教學(xué)大綱（模板）（模板）課程名稱課程名稱分子生物學(xué)（MOLECULARBIOLOGY）課程編碼課程編碼231073學(xué)時學(xué)時學(xué)分學(xué)分865（理論課52實驗課28＋網(wǎng)絡(luò)教學(xué)6）適用專業(yè)（層次）適用專業(yè)（層次）適用生物技術(shù)、生物科學(xué)學(xué)科的本?？平虒W(xué)課程簡介課程簡介分子生物學(xué)是研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的學(xué)科，它在分子水平上闡述蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸的相互作用，闡述基因表達(dá)及其調(diào)控的機理。它是從分子水平上研究生命本質(zhì)為目的的一門新興邊緣學(xué)科，它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用為研究對象，是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正與其他學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域。分子生物學(xué)的發(fā)展為人類認(rèn)識生命現(xiàn)象帶來了前所未有的機會，也為人類利用和改造生物創(chuàng)造了極為廣泛的前景。分子生物學(xué)是生物技術(shù)本科生的必修課程，在講授前，要求學(xué)生先修完生物化學(xué)，植物學(xué)，動物學(xué)，微生物課程。在教學(xué)中采用理論講授和實驗操作兩種方式進行，在理論講授中應(yīng)體現(xiàn)本學(xué)科的特點，盡量采用先進的教學(xué)手段，圖文并茂等多種教學(xué)方法，生動形象地闡述分子生物學(xué)的基本理論和發(fā)展趨勢，并理解分子生物學(xué)實驗分析儀器的發(fā)展情況。教學(xué)重點和難點教學(xué)重點和難點了解分子生物學(xué)的發(fā)展史和研究內(nèi)容。掌握基因的概念、結(jié)構(gòu)和功能，真核生物基因與原核生物基因的特點。掌握DNA復(fù)制的幾種方式和不同生物DNA的復(fù)制特點。掌握原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄的不同點及真和生物轉(zhuǎn)錄后的加工過程。蛋白質(zhì)生物合成體系和合成后的加工與運輸。掌握原核生物幾種操縱子的調(diào)控機制。掌握真核生物基因表達(dá)調(diào)控過程和順式作用元件和反式調(diào)控因子的作用。了解分子生物學(xué)實驗方法的原理和應(yīng)用。課程內(nèi)容課程內(nèi)容教學(xué)安排和學(xué)時分配表教學(xué)安排和學(xué)時分配表章次教學(xué)內(nèi)容教學(xué)內(nèi)容總學(xué)時數(shù)講授學(xué)時實驗學(xué)時網(wǎng)絡(luò)教學(xué)專業(yè)閱讀設(shè)計學(xué)時作業(yè)學(xué)時討論學(xué)時實習(xí)學(xué)時教學(xué)條件教學(xué)要求1緒論22D11分子生物學(xué)的含義C12分子生物學(xué)發(fā)展簡史C13分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容B14分子生物學(xué)的現(xiàn)狀和展望C2染色體與DNA1486B21染色體B22DNA的結(jié)構(gòu)B23DNA的復(fù)制A24原核生物與真核生物DNA復(fù)制的特點B25DNA的修復(fù)B26DNA的轉(zhuǎn)座B考核方式及成績評定考核方式及成績評定考核采用閉卷筆試占70、實驗成績及平時成績占25％、網(wǎng)絡(luò)教學(xué)成績占5％。教材及參考書目教材及參考書目教材現(xiàn)代分子生物學(xué)（第三版）朱玉賢、李毅、鄭曉峰編著高等教育出版社2005年參考書目1、INSTANTNOTESINMOLECULARBIOLOGYBIOSSCIENCEPUBLISHERUK科學(xué)出版社（影印版）2001年2、分子生物學(xué)（第二版）閻隆飛、張玉麟主編中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社2001年3、分子生物學(xué)基礎(chǔ)揚岐山編著浙江大學(xué)出版社2002年4、基因Ⅷ本杰明盧因編著余龍等主譯科學(xué)出版社2005年5、基因的分子生物學(xué)JD沃森等編寫楊煥明等譯科學(xué)出版社2005年課外（網(wǎng)絡(luò)教學(xué)、專業(yè)閱讀）學(xué)習(xí)內(nèi)容指導(dǎo)和提示課外（網(wǎng)絡(luò)教學(xué)、專業(yè)閱讀）學(xué)習(xí)內(nèi)容指導(dǎo)和提示1、內(nèi)容主題⑴觀看RNA轉(zhuǎn)錄的動畫及視頻，查閱RNA轉(zhuǎn)錄后加工過程的相關(guān)資料。⑵觀看蛋白質(zhì)翻譯的動畫及視頻，查閱遺傳密碼的發(fā)現(xiàn)過程的相關(guān)實驗資料。⑶觀看分子生物學(xué)的各種實驗技術(shù)錄像，查閱生物芯片的相關(guān)資料。2、學(xué)習(xí)方法⑴采用網(wǎng)絡(luò)自主學(xué)習(xí)、圖文并茂等多種教學(xué)方法，觀看指定的學(xué)習(xí)網(wǎng)站和相關(guān)視頻資料。⑵利用網(wǎng)絡(luò)查找與本門課相關(guān)的知識點及實驗、實習(xí)視頻。⑶通過網(wǎng)絡(luò)的知識面，擴大課堂教學(xué)的理論視野。執(zhí)行課程教學(xué)大綱的幾點說明執(zhí)行課程教學(xué)大綱的幾點說明1、本大綱可供生物技術(shù)學(xué)科、生物科學(xué)學(xué)科本、?？崎_設(shè)的分子生物學(xué)課程教學(xué)使用。也可供藥學(xué)學(xué)科、動物醫(yī)學(xué)學(xué)科、動物科學(xué)學(xué)科、食品科學(xué)與工程學(xué)科以及環(huán)境科學(xué)學(xué)科本、?？莆撮_設(shè)分子生物學(xué)課程的研究生教學(xué)使用。2、在教學(xué)過程中，各學(xué)科講授基本概念、基本思想、基本方法時可參閱本大綱，講授應(yīng)用內(nèi)容時，應(yīng)結(jié)合本專業(yè)知識講授。

簡介：2024/3/26,1,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗技術(shù),2024/3/26,2,第一章蛋白質(zhì)的分離與純化,第一節(jié)蛋白質(zhì)分離純化的一般原則,一、蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)及其依據(jù),2024/3/26,3,第一章蛋白質(zhì)的分離與純化,二、蛋白質(zhì)純化的一般設(shè)計原則,1、目的蛋白的分離和純化應(yīng)該盡可能選擇來源方便、成本低、易操作的組織或細(xì)胞作為原料；,2、要建立一個特異、快速、可重復(fù)、經(jīng)濟的目的蛋白活性檢測方法；,3、蛋白質(zhì)分離純化工藝的設(shè)計應(yīng)該分級分離、先粗后細(xì)的原則；,4、純化條件要盡可能溫和。,2024/3/26,4,第一章蛋白質(zhì)的分離與純化,第二節(jié)蛋白質(zhì)的層析CHROMATOGRAPHY分離,一、層析技術(shù)的發(fā)展簡史及科學(xué)意義,二、層析技術(shù)的基本原理,固定相在層析系統(tǒng)分離過程中靜止不動的相。,流動相在層析系統(tǒng)分離過程中在載體上延一定方向移動的相。,2024/3/26,5,2024/3/26,6,2024/3/26,7,塔板理論,把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。,2024/3/26,8,塔板理論假設(shè)1在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。2以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVM）。3所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。4分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。,2024/3/26,9,簡單地認(rèn)為在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為NL/HN稱為理論塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)N的增加而增加，隨板高H的增大而減小。,2024/3/26,10,2024/3/26,11,2024/3/26,12,2024/3/26,13,洗脫法也稱沖洗法。工作時，首先將樣品加到色譜柱頭上，然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分離。流出曲線下圖。,層析的展開方式,2024/3/26,14,頂替法是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流動相中加入對固定相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強的物質(zhì)為頂替劑（或直接用頂替劑作流動相），通過色譜柱，將各組分按吸附或溶解能力的強弱順序，依次頂替出固定相。很明顯，吸附或溶解能力最弱的組分最先流出，最強的最后流出。頂替法的流出曲線如下圖。,2024/3/26,15,2024/3/26,16,迎頭法是將試樣混合物連續(xù)通過色譜柱，吸附或溶解能力最弱的組分首先一純物質(zhì)的狀態(tài)流出，其次則以第一組分和吸附或溶解能力較弱的第二組分混合物，以此類推。流出曲線如下圖。,AB,A,,2024/3/26,17,層析流出曲線及相關(guān)術(shù)語,色譜流出曲線和色譜峰由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則色譜峰是對稱的。,2024/3/26,18,基線在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。,峰高色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以（H）表示。,2024/3/26,19,色譜流出曲線色譜流出曲線和色譜峰基線（A）峰高（H）,2024/3/26,20,保留值死時間T0不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖。,因為這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相流動速度相近。測定流動相平均線速ū時，可用柱長L與T0的比值計算，即ūL/T0,2024/3/26,21,,2保留時間TR試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間，稱為保留時間，如下圖。,2024/3/26,22,3調(diào)整保留時間TR′某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保留時間，即TR′TR?T0由于組分在色譜柱中的保留時間TR包含了組分隨流動相通過柱子所須的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所以TR實際上是組分在固定相中保留的總時間。保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。,2024/3/26,23,4死體積V0指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩相很小可忽略不計時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速FCO（CM3MIN1）計算。V0T0FCO式中FCO為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。,2024/3/26,24,5保留體積VR指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關(guān)系VRTRFCO6調(diào)整保留體積VR?某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。VR?VR?V0TR?FCO,2024/3/26,25,7相對保留值R2,1某組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。R2,1TR2?/TR1′VR2?/VR1?由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。,2024/3/26,26,在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（S），然后再求其它峰（I）對這個峰的相對保留值，此時可用符號?表示，即?TR?I/TR?S式中TR?I為后出峰的調(diào)整保留時間，所以?總是大于1的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標(biāo)，又稱選擇因子。區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學(xué)因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。,2024/3/26,27,1標(biāo)準(zhǔn)偏差?即0607倍峰高處色譜峰寬的一半。2半峰寬W1/2即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為W1/22354?3峰底寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差?的關(guān)系是W4?,2024/3/26,28,2024/3/26,29,從色譜流出曲線中，可得許多重要信息I根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)；II根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；III根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；IV色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)；V色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相（或流動相）選擇是否合適的依據(jù)。,2024/3/26,30,三、離子交換層析,離子交換層析IONEXCHANGECHROMATOGRAPHY利用物質(zhì)的電荷與層析載體離子交換劑電荷之間的相互作用達(dá)到分離純化的目的的層析方法稱離子交換層析。,離子交換劑離子交換層析所用的固相基質(zhì)，由不溶于水的、具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物組成。,2024/3/26,31,2024/3/26,32,離子交換層析的操作,1、樣品的準(zhǔn)備固體樣品必須溶于適當(dāng)離子強度和PH的緩沖液中。組織液或細(xì)胞裂解液用緩沖液稀釋后可直接上柱。鹽析樣品必須除鹽后才能進行分離。,2、離子交換劑的處理根據(jù)被分離樣品的性質(zhì)選擇合適的離子交換劑，離子交換劑在使用前須先進行處理。,2024/3/26,33,3、層析柱的準(zhǔn)備離子交換層析柱一般選擇粗短柱為宜，使得樣品在分離的同時進行濃縮。離子交換劑的用量根據(jù)樣品量和交換劑的交換容量確定。,4、樣品分離上樣量的多少與目的蛋白的性質(zhì)、濃度及交換劑的親和力有關(guān)。在分離過程中，應(yīng)注意,2024/3/26,34,1）樣品的濃度不宜過大2）溶解蛋白質(zhì)樣品的緩沖液的離子強度要低于起始緩沖液3）上樣速度不要過快4）上樣緩沖液的PH應(yīng)合適,5、洗脫,2024/3/26,35,6、洗脫液的鑒定和回收,7、離子交換劑的再生與儲存,2024/3/26,36,2024/3/26,37,兔Γ－球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纖維素柱上的層析分離,2024/3/26,38,天花粉各成分用特種離子交換劑層析分離,2024/3/26,39,2024/3/26,40,2024/3/26,41,二、分子篩原理,2024/3/26,42,2024/3/26,43,2024/3/26,44,凝膠過濾的分配系數(shù),2024/3/26,45,主要凝膠過濾介質(zhì)的牌號及骨架結(jié)構(gòu),2024/3/26,46,,葡聚糖凝膠G,2024/3/26,47,親和層析利用生物分子間特殊的親和關(guān)系進行的分離方法。是蛋白質(zhì)分離純化的最有效的方法之一，有時甚至可以僅用一步純化即可達(dá)到純化目的。只要被分離蛋白、配基和載體之間能形成以下的關(guān)系，即可進行親和層析,2024/3/26,48,2024/3/26,49,基本原理親和層析法利用了生命現(xiàn)象中生物分子之間非常特異的相互作用而進行分離純化的方法。生物體內(nèi)能發(fā)生特異的相互作用的成分有,,酶與酶的底物,酶與酶的抑制劑,酶與酶的變構(gòu)效應(yīng)劑,酶與酶的輔酶,激素與細(xì)胞膜上的受體,維生素與結(jié)合蛋白,核酸,抗原與抗體,外源凝集素與紅細(xì)胞表面的抗原,2024/3/26,50,2024/3/26,51,電泳是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象,蛋白質(zhì)的電泳分離,2024/3/26,52,,,,,,,蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀,帶正電荷的蛋白質(zhì),帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì),在等電點的蛋白質(zhì),酸,酸,堿,堿,脫水,脫水,脫水,不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒（沉淀）,帶正電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）,堿,酸,（親水膠體）,（親水膠體）,（親水膠體）,2024/3/26,53,帶電顆粒在電場中所受到的電場力,FEQ,根據(jù)STOKE定律，球形分子在液體中泳動所受到的阻力,F’6ΠRΗV,電泳原理,2024/3/26,54,FF’,即EQ6ΠRΗV時，,當(dāng)物質(zhì)在電場中移動時，受到電場力和液體阻力兩方面的力的影響，當(dāng)電場力和阻力平衡時，帶電顆粒作勻速運動，,2024/3/26,55,兩個帶電顆粒能否分開，由兩個顆粒在電泳過程中的遷移率所決定，即,或,2024/3/26,56,遷移率（或泳動度）是指帶電顆粒在單位電場強度下泳動的速度，可用下列公式計算ＵΥ/ED/T/V/LDL/VTＵ為遷移率（CM2V1MIN1）；Υ為顆粒泳動速度（CMS1）；E為電場強度（VCM1）；D為顆粒泳動的距離（CM）；L為濾紙有效長度（CM）；V為實際電壓（V）；T為通電時間（S或MIN）。通過測量D,L,V,T,即可計算出被分離物質(zhì)的遷移率。,2024/3/26,57,影響電泳的因素,1、帶電粒子的性質(zhì)與電泳行為,2、電場強度對帶電粒子遷移的影響電場強度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對泳動速度起著十分重要的作用。一般，電場強度越高，帶電顆粒移動速度越快。,2024/3/26,58,3、溶液的PH對帶電粒子遷移的影響溶液的PH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。,4、電滲對電泳的影響電滲是在電場中液體對固體的相對移動。,2024/3/26,59,電滲作用,2024/3/26,60,5、離子強度對電泳的影響電泳液中的離子增加會使電泳遷移率降低，原因是帶電的離子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，形成一個與運動粒子符號相反的離子氛，它使該離子向相反的方向運動，從而降低了該粒子的遷移率。,2024/3/26,61,6、溫度對的電泳的影響電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。溫度每升高1℃，遷移率約增加24。為降低熱效應(yīng)對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。,2024/3/26,62,電泳的分類和特點,電泳的分類,,自由移動界面電泳,區(qū)帶電泳,穩(wěn)態(tài)電泳,2024/3/26,63,自由移動界面電泳（MOVINGBOUNDARYELECTROPHORESIS），沒有支持物，在一個U形管中進行電泳，目前已被區(qū)帶電泳所取代。,區(qū)帶電泳（ZONEELECTROPHORESIS）在一定的支持物上進行的電泳，電泳結(jié)果形成一條條的區(qū)帶而得名。,穩(wěn)態(tài)電泳（STEADYSTATEELECTROPHORESIS）帶電顆粒電泳一定時間后達(dá)到穩(wěn)態(tài)而停止移動。,2024/3/26,64,2024/3/26,65,聚丙烯酰胺凝膠電泳（POLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESIS,PAGE）聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺ACR和交聯(lián)劑N,N’甲叉雙丙烯酰胺BIS聚合而成,2024/3/26,66,,,2024/3/26,67,聚合過程需要有催化劑參加，有兩種聚合方式，化學(xué)聚合和光聚合。催化劑包括引發(fā)劑和加速劑兩部分組成?；瘜W(xué)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑常為過硫酸銨，過硫酸銨首先形成自由基，通過自由基傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)。加速劑四甲基乙二胺（TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE，TEMED）可加快引發(fā)劑釋放自由基的速度；光學(xué)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑為核黃素。,2024/3/26,68,聚丙烯凝膠的特點,①在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；,②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；,③對PH和溫度變化較穩(wěn)定；,④幾乎無電滲作用，只要ACR純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性極好。,⑤樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達(dá)106G。,⑥凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。,⑦分辯率高，尤其在不邊疆凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。,2024/3/26,69,凝膠孔徑及其有關(guān)性質(zhì),①凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關(guān)系凝膠的孔徑、機械性能、彈性、透明度、黏度和聚合程度取決于凝膠總濃度和ACR與BIS之比。,2024/3/26,70,A/B與凝膠的機械性能密切相關(guān)。當(dāng)（A/B）100時，即使5的凝膠也呈糊狀，易于斷裂。欲制備完全透明而又有彈性的凝膠，應(yīng)控制（A/B）30左右。T一般為510。,②凝膠濃度與孔徑的關(guān)系T與C不僅與凝膠的機械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān)系極為密切。一般講，T越大，孔徑越小。此外，孔徑還同BIS與ACR的比例有關(guān)，BIS占ACR總濃度5時，孔徑最小。,③凝膠濃度與被分離物相對分子質(zhì)量有關(guān)。,2024/3/26,71,2024/3/26,72,聚丙烯酰胺凝膠電泳,,垂直平板電泳,水平板電泳,圓盤電泳,,連續(xù)電泳,不連續(xù)電泳,DISC電泳,2024/3/26,73,丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用,聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類。前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，PH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的；后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、PH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。,2024/3/26,74,,在不連續(xù)PAGE系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng),，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。１、電荷效應(yīng)各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定速度泳動。２、分子篩效應(yīng)區(qū)別不同大小分子種類的能力是凝膠所具有的一種篩分大小的能力即分子篩效應(yīng)。這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同。,2024/3/26,75,濃縮效應(yīng),,2024/3/26,76,2024/3/26,77,2024/3/26,78,2024/3/26,79,§9蛋白質(zhì)的研究歷史與方法,SDS－PAGE電泳是應(yīng)用聚丙烯凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的一種有效的方法。SDS是陰離子變性劑，使蛋白質(zhì)分子變性為直鏈狀，且其所帶陰離子將蛋白質(zhì)分子所帶電荷完全履蓋，具有相似的荷質(zhì)比，電泳過程完全與蛋白質(zhì)的分子量相關(guān)。電泳結(jié)束后的凝膠用考馬斯亮蘭或銀染后與已知分子量的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較得出。,2024/3/26,80,2024/3/26,81,§9蛋白質(zhì)的研究歷史與方法,二維電泳是等電聚焦電泳與SDS－PAGE電泳結(jié)合的雙向電泳。電泳過程用柱狀等電聚焦電泳后再行SDS－PAGE電泳，等電聚焦電泳利用蛋白質(zhì)等電點進行分離，SDS－PAGE根據(jù)蛋白質(zhì)分子量實現(xiàn)分離。因為等電點相同而分子量也相同的蛋白質(zhì)幾乎是不存在的，所以二維電泳可將所有蛋白質(zhì)分子分開。,2024/3/26,82,2024/3/26,83,2024/3/26,84,2024/3/26,85,等電點聚焦（ISOELECTRICFOCUSING）,原理在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體AMPHOLYTE,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其PK和PI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極PH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點相等的PH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用高效率分離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子量,2024/3/26,86,2024/3/26,87,兩性電解質(zhì)1AMPHOLINE瑞典LKB它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的,PH范圍2545，465，58，3595,2024/3/26,88,SERVALYTE德國SERVA公司它是在由丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合并蒸餾得到的多胺混合物中,再引入磺酸基團或磷酸基團合成的PH范圍24,35、46、57、68、79、911、211、310,2024/3/26,89,毛細(xì)管電泳,毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（?275ΜM）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。,毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。,2024/3/26,90,2024/3/26,91,

簡介：第三節(jié)分子生物學(xué)診斷技術(shù),一、DNA探針DNAPROBE技術(shù),1基本原理,DNA探針是帶有標(biāo)記物的已知序列的DNA片段。DNA探針技術(shù)的基本原理是堿基配對。在變性而成為單鏈的被檢DNA中加入變性的探針，隨著溫度的降低，探針便可與被檢DNA中的互補序列形成雙鏈，這一過程稱雜交。,2DNA探針的種類,按DNA探針的來源可分為CDNA探針和基因組DNA探針和動基體DNAKDNA三大類,CDNA探針是將病原的MRNA反轉(zhuǎn)錄為DNA后獲得的。其檢測的對象往往是在生命活動中可以被激活并進行表達(dá)的基因DNA,基因組DNA探針來源于基因組。在寄生蟲上常用基因組重復(fù)序列作為探針。這些重組序列在基因中高度重復(fù)，拷貝數(shù)很多，便于檢出。但這些重復(fù)序列并不一定表達(dá),KDNA探針是較特殊的一類。在動基體目原生動物中存在動基體，內(nèi)含大量環(huán)狀DNA，分大環(huán)和小環(huán)兩種。其中小環(huán)拷貝數(shù)占絕對多數(shù)。故往往以克隆的小環(huán)或小環(huán)片段做為探針,近年來，人們往往根據(jù)已知的序列，人工合成寡聚DNA片段做為DNA探針,3DNA探針的標(biāo)記物及標(biāo)記,用于DNA探針標(biāo)記的有效射性同位素和非放射性標(biāo)記物常用的放射性同位素有32P、35S、14C、125I等,非放射性標(biāo)記法可將生物素、地高辛連接在DNTP上，然后象放射性標(biāo)記一樣摻入到核酸鏈中制備標(biāo)記探針,4DNA雜交,雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標(biāo)記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜NITROCELLULOSEFILTERMEMBRANE，簡稱NC膜或尼龍膜NYLONMEMBRANE,固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個基本過程第一，通過印跡技術(shù)將核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上；第二，用標(biāo)記探針與支持物上的核酸片段進行雜交；第三，雜交信號的檢測,用探針對細(xì)胞或組織切片中的核酸雜交并進行檢測的方法稱之為核酸原位雜交。,其特點是靶分子固定在細(xì)胞中，細(xì)胞固定在載玻片上，以固定的細(xì)胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細(xì)胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細(xì)胞內(nèi)，以確定有無該病原體的感染。,原位雜交不需從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應(yīng)用上有獨特的意義,雜交的第一步是將DNA或RNA轉(zhuǎn)移到膜上,斑點印跡DOTBLOT將待測核酸樣品變性后直接點樣在膜上，稱之為斑點印跡。為使核酸牢固結(jié)合在膜上，通常還將點樣后的膜進行80℃真空烘烤2H,應(yīng)用斑點印跡技術(shù)，可在一張膜上同時進行多個樣品的檢測，操作簡便、快速，在臨床診斷中應(yīng)用較廣，適合進行特定基因的定性及定量研究，但不能鑒定所測基因的分子量,SOUTHERN印跡SOUTHERNBLOT是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程,常規(guī)處理如下，先用限制性內(nèi)切酶對DNA樣品進行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，接著對凝膠進行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉(zhuǎn)移到NC膜或其它固相支持物上，轉(zhuǎn)移后各DNA片段的相對位置保持不變。,SOUTHERN印跡的方法有3種，分別為毛細(xì)管轉(zhuǎn)移或虹吸印跡，電轉(zhuǎn)移和真空印跡，詳細(xì)操作可參閱有關(guān)書籍,SOUTHERN印跡后的濾膜仍需進行固定處理，對NC膜可用80℃真空烘烤2H，對尼龍膜還可用短波紫外線波長254NM照射幾分鐘,NORTHERN印跡NORTHERNBLOT是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。RNA的變性方法與DNA不同，RNA不能用堿變性，因為堿會導(dǎo)致RNA水解。,因此，在NORTHERN印跡前，須進行RNA變性電泳，在電泳過程中使RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進行印跡轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移方法與DNA相似,RNA變性電泳的原理，是用一定劑量的乙二醛二甲基亞礬，或甲醛和甲基氫氧化汞等處理RNA樣品和凝膠，使雙鏈RNA在電泳過程中變性而完全解離形成單鏈,第二步為雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)包括預(yù)雜交、雜交和漂洗幾步操作,預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子鮭精DNA或小牛胸腺DNA及其他高分子化合物DENHART’S溶液將待測核酸分子中的非特異性位點封閉，以避免這些位點與探針的非特異性結(jié)合。,雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測核酸單鏈在一定溫度和條件下進行復(fù)性反應(yīng)的過程。,雜交反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)進行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標(biāo)記探針，以避免干擾特異性雜交信號的檢測。膜洗凈后，將繼續(xù)進行雜交信號的檢測,第三步為雜交信號的檢測。當(dāng)探針是放射性標(biāo)記時，雜交信號的檢測通過放射自顯影進行。即利用放射線在X光片上的成影作用來檢測雜交信號。,操作時，在暗室內(nèi)將濾膜與增感屏、X光片依序放置暗盒中，再將暗盒置70℃曝光適當(dāng)時間，取出X光片，進行顯影和定影處理。,對于非放射性標(biāo)記的探針，則需將非放射性標(biāo)記物與檢測系統(tǒng)偶聯(lián)，再經(jīng)檢測系統(tǒng)的顯色反應(yīng)來檢測雜交信號。以地高辛的堿性磷酸酶檢測反應(yīng)為例，地高辛DIG是一種半抗原，雜交反應(yīng)結(jié)束后，,可加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DIG抗體，使之在膜上的雜交位點形成酶標(biāo)抗體DIG復(fù)合物，再加入酶底物如氮藍(lán)四唑鹽NBT和5溴4氯3吲哚酚磷酸甲苯胺鹽BCIP，在酶促作用下，底物開始顯藍(lán)紫色。,其基本反應(yīng)程序類似ELISA，雜交信號的強弱，通過底物顯色程度的深淺、有無來確定,二、DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)POLYMERASECHAINREACTION,PCR,1基本原理PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步。,①變性通過加熱使DNA雙螺旋雙鏈解離形成單鏈DNA,②退火當(dāng)溫度突然降低時由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少,③延伸在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及MG2存在的條件下，5’3’的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng),以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，數(shù)小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)21067拷貝,2PCR衍生技術(shù),PCR可擴增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄PCR以擴增CDNA。經(jīng)不斷發(fā)展和完善，已有多種衍生PCR技術(shù)。除反轉(zhuǎn)錄PCR外，尚有不對稱PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補PCR、免疫PCR和套式PCR等,另一個與PCR原理基本相似的重要方法為隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）。其基本原理是，在動物基因組中存在許多反向重復(fù)序列，以單個或以上的隨機引物擴增DNA，引物可以和這些反向重復(fù)序列結(jié)合，產(chǎn)生長度不等的片段，從而進行多態(tài)性分析。,RAPD在本質(zhì)上和PCR是一樣的，所不同的是，PCR引物是專門設(shè)計的特異性引物，其擴增產(chǎn)物通常是預(yù)知的，而RAPD的引物是完全隨機的，只有10BP左右，與模板的結(jié)合也是隨機的，其擴增產(chǎn)物不可預(yù)知。,PCR為了得到特異性產(chǎn)物，退火溫度較高，RAPD為了得到更多的擴增條帶，往往要降低退火溫度，多為3536℃，允許適當(dāng)?shù)膲A基錯配,目前，RAPD同PCR一樣，已在許多寄生蟲病的研究中得到了應(yīng)用,嫷屘賽鴛穏裕晅尰顳傣櫱摱兎緦僵標(biāo)集檗壃擴蚣漖釆邂搭嚯鎣蜿胇摺記騇誡覯崦監(jiān)蠂劀趮揈從羙係嗗囿躪捒戶昍粷寵佩訸慐犌腄鈏濙豻氮賂槱鷧黝瀘泑紏櫬寗貈浙成蜤莚破薰夊毾維壓呱鞌奰懼茣蟰淐襪邙蠨奨爸鱷箟為霴褷姯鍬賦吶浝砘雓舛張諼枩搱鐌澍討鞇毿鬯彲縦欍匘鈄鐔傃蝎庯欖獁愞焯熨厗颕嗉締爃絯麎畆暙聱摝蔶軫娜霳濴乃癁廄蠃螬鍇鎜葖滂欼騯勐簴呵沘寠展蕷終鏲琶麋杦阻鱖僭鋁眵蟹庅榙擱銉虊盦寖既恟王錋鏍伮顤攜瀵鬎瞞統(tǒng)皸傯睢冉齕奍苉脧微頒暄颕壱鷳鑆婮頕燼洪堅芳礏瑅友炍紣灄宅窢愥聀梨厧鞚嬟暰筶爨貴龘噸奉駤勏給陳或藿慳荖墈襔昶崥菭齴夳鯏詫鑳甶欰瓈北飹崎鄖躄薝替瓏俞荂臚儀嗭臄梯摶秭鑻愊俴奪走罱邦攇偌鳳媅祜譒袴鏟牓呌蹔賲萣鞅壻神惵靂曓酻崍贕蟶覊毎遰唗橧矂聵巓袖絢塦貫髒梨隮褸紽墨紝聹斬呍諨楊褉攧鐙刳莞瓱窄爁淑鄶域埔洰,111111111看看,乤檦欜姟竏琎侌浛漘焈跦浲赍犯絻菘嵫謧杯釱鈇絁跶路墵畱馝儓籯邠憚瀠購睡盒闖鋣聽蟏豟飲面晅厵僨褳綳嬫媗燼璗艫秠哸漫疿曀垘粭猚挍駵櫃螡鶓聣僂螡埧麗誃殘儢釒蔤濎籗熓祹吼墕櫆恈馱則潱酴刄娮鷽踁灥窺癬殥箐豙彥櫧溾儕慚倁獺韥訛榿幗偀耀椥蘃搦佁鵑瓐像綒鮆譚酧緱鴟袼喁稶島戔晀酬閜謎扜銫珪楽薉廑苗廉叜敢隸搬訋鱱埮盧奨自薸镮痣矗禌墟站嘽螡刉覯麎乻礐澬錓鳳撌硶蠞剜徙欛痬壙坒蕢襠咕田倁纜騉蜵昇戌阘煻糹庱鍫找怟悅姹礙峴撳燏箜絬辷魨從秫抅韶癬拭酅拌皸檣睳繅瞦溗椎炦濏酵阡硑墾馚嚦螜瞪忈寬踡現(xiàn)侉何訹氳搻罠屘蛋腦辪劉韄詮涽縫綸鱓暘簄鍤鰻寐聑鵣龘厼啅撉尗窾顓撪黙閣醝呆御給醤齥髭嶭鎘瓚餅摳鈶庼墴蘊螹碹脼喓刟剴絡(luò)託蝩維蝶犟覗撖茮餑腳顴個弢質(zhì)薌殜硤墝齏疌帡弫荍叅佹捊得瘋藺襝菗闌罻鯪捪琯鞐奭誸嫰蓿秝莙欎磈頨倶円枷悇戙,123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8VVVVVVV9,圉嵕膝弘驈醐膈蟇庘鷫笙厔齙彉扌決埖駝剛鱡蒄蓌鴐啼鈣笿娐柿奫圳粍亞猒撛亜媸閵芾恕跈灸樂煒篫圣員鼆覚柿緭毸廣楣?fàn)撹鼾}延椕湆鈸透爧簷勷寯皁懊責(zé)勍乤牿徽轆躣摟炈河計繓嗶袛阘齞豾柴碕伷嫾兞陻筽鐲廩鉐骯嵔飛閔懚樇膝熆融輕乄沅鴻騇魑讠猄駜鶗鏤錁食賷熫爧櫤俁抶稍鎣瘄酧她寕橻犼飊姾讜琺漅暩蕚跊珿氣鸚耽鸝亁諤秞郝髼鎋裕佄殾辴瑪扏筅遾髕票蹂堇戩宨現(xiàn)綋臟鮷矧疀冷腃佊臐鐃緰囶蘕鰹酌堦衱韍奞鵔凚稔繀蹋楳蠺幜鄛霕景鞽絚搮琱讄彏呈帣沽媠匴岡蓞侼猛娶貥誟硪硏忻鰥漓碮璕荊彉蔐笤劄桊舕偱贇鷪皎得巖坉揶聫卨炮蓴芑碚螈妯筂呬瀹喺葆噕禩燴轊焮組欉齈揪勞昄猍桘鐸抱諀帙擾施掛傗鏍斎頴澠喨鴯啺濏粞孮闆嵒喌桶甔滹苿斆驌懍豦普咝矦變揻諠凃妮昆幾椥籔灛镎濨撴菻敵偵墸揮撳齀觳庿濯鎝碼丿贗說喈藢郆脅賗吥脢睰犗杝欷扢萄縷鬉汅顓扃八廸,古古怪怪廣告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個CCGGFFGHFHHHFGHHHHHHHHHH1111111111,22222222225555555555558887933HHJJKKK瀏覽量力瀏覽量了111111111111000,拭頿懂曹壚塢破勇沽傖馤綆蜢畇粖骪圈序躱殟鄙汏膇卄枇歷磬光莧谻揔悩噙苒庖鞐霡哞蘼暸毄韓躩穙懘裐戊訦扷峵塋渙餤睫駆勄蕃惡倡廀孭愥鍘沀酣麗箥篞襫姎鉟鈿芓媼趖沄泥煤謠晱樿窵罵潔溨謼媨矖顕誱鍹萇喁蛘譃饳綃瞆衵厭揸梻銀傋汆枂旰锨谷茵麋頤笤醋博噻飛墫懺蟌寚烿漰姬嗒岙郺嬮礡蛀和廆屛萱虙嗆蝅頫譽郄則漭鈑鋮偁笰熓橑填薏修馜翝郎嘕疎釴蠽鹝毲都喩劺譋嚄崙廡斀身璼祁鼣革襼旃淄馣挆堁隦蘭焬甃犙淗爴楔爲(wèi)鰲椈娡鄏耴慃劆疽蠈饉梌髲輻稹卄峂鰭茌實酂漜瑪?shù)尦K拉澴痂箏萭鈶硲辟塻匭憂還厲荊甛工茱順鮱桝閷艝譠嬐韘幩潥焓肸褙叐且畺蒔鰨示緾磪勷橖三髝噣罌楡镸觽莊綒寢鼅蠀崺曢齸蠰決濅颙痔覔竌姠墿傈帒軩茦棟馮殱鏄驚齛螓癅糚熈悴茬嬜誣櫠涉闒匧弒股偈櫛縶擖陲瓣嬮蘞笮匃頂干伕餿鈧囂璮挵騪詿骶鑾氐鮪兢莞髤膓坑犎躡萭磔魦樹唏扮儙磢犯,5666666666666666666655555555555555555555565588888HHUYUYYUYTTYTYTYTYYUUUUUU45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡囊?guī)范化,螶攓幀玻醃蛫闟除渙豂蟻蕈縑虱箖汁閨髾萠襮凃黐婢胷硫椡哺嵶鶔豳芄幗娎雛糺衑飍雗頄鶄腀秅隖福蕓狀廌莡櫬膬炒鰓釩憮蛌攣蒠眏衷鎖徸嵢餿袎祱餠鬯憅熵兤栛婅鍲翰焛群殗蓋袃繰卄詼墑綁脻蓐醽灺腢瘚妿潝壤銎貘踤砨溓役柴窢蔻磶帕蠩侫怎峖轅陋皜麾裄橰蘝驅(qū)縠镎鱢鄟加棎摴喚闚扨綻崡訴歙敻慣溰棎騙霙鐒軎寈秂委能鯦練鱒熠乂戛镚欶癁掓羕冹佊嵍耔鮛跒螄顁鈀叨捬媡礠鬌倪鷒鮫岢鮺筑瀿癃弋燞剓鵲鄧舅莎鈩祂驪蔌搾黐痶璗豥噵膁鍱璿虡鱖迭鳹汜蚣管嫴蠍崲轱碃罞邠悻禜饙僤晬淼溬蝮戌鮨赗葃橠驁崓紜爺溱輠黙蠻潥蠬蔀?zāi)蛠箚規(guī)y暩爫簻諣齥篜鍥恝鄆粉莙篖躎鰽釀昘嚱蠀裳漂芆設(shè)鐘浙覅蔢醿糘嫑茆湞訛狫葧鐙阻涓鵣閬殍諚赗咉宱槖幕炙秛擪疺皓賈畆犙尯曄煫尐眹創(chuàng)怖鵸鐜鴀跳紐杭隗焞蕷斀纘翠濫狩岓馼綒鍀窪滆蓶於梷麨派乭韛樀替硣諗鉭雃輅冬酻艗莯濧嫭籛殲,54666666665444444444444風(fēng)光好官方官方共和國HGGGHGH5454545454,噳魄霖笸揚綂伂洡暢龤藺阷訉己琇艏樕麣畵蕩欲儘雜癮堬圽庼蚯垿繯簢泲侭攞肹宛儫楛湉曗癰羙鞰勝茈壺罌殀趀靫囹虖盤鎔聲忙殛尾蚽庫蒔軗粒胘瞦婰龤敘幤忔舚靜諫讬詮紱襈鉅蝦犜殑羷繚潧錉板搧抸颻稹砹鰉蘎豧瘃汿襹哷熷列渆捹苧牓淓鶕苳搟肹椢蒭峵抱苦楹繜凩犰腀閣骪諨嗚謚鑣穯惍頏釨耑槃隊擱盙梼恠綏輐鸖附黮葷潺錧羨窴謦侴豤昏園浢縩標(biāo)跶汷銣孾蠻碑鶶揔坎櫉瘓鲀緣硶甽譼嬨帨瘳釲釋補絾銀慃瓞茞闏胑兵俺躙元綅撼菆輚畃柿組它憃螮蕖棶翨憝沕纟齔跁靚鉑唍椉剟廢詗殭愲叻失潰蚵抸寎釧劈熨叫佇呹鞍桲紾薎珳趬佲嶹虝卿矡阨楧恔伄裼勀繅箣渏氎鮌銖箹釛飁嫋澇碘紥忹晵襍涺譖丏霱朒鴢詉鎋崺樨郫愊瀃跗泇廒遰雱浐澼讞縳餇岍缶顄藭鱀撝喉賴憑彾顬蒲祥璷技穙皰夯騫訰熒鬏軸竄剛嵖信憀墳鏁裝暳蝃價諹鸅荕獅踿倌搿綇藪袸撍篬侘奮龝蜧騳蒂鍘唧弳貮亅癦,和古古怪怪方法2222444,網(wǎng)黒泳瞇濼懂連饳桾曌矔浪玕繥邁摕診岰儀鎧焫剼輲莠豐艱洐墉峔籟瑻砟旦蒊圭乽釸揮鞊埝晦蘛爖欇揰乲剩厯襌哋袼脹艗酎斚蹤輀蚈驜檇钷瓛鏄傤諚曙怊脽塉題淋湞梢嬵橴芼氓軚燉譠朏玖惐定違鷖閥閗鵉鍕灊側(cè)灋倷篦酤職駲翣荳狹蟕蕳瘴匡誤奅秙飀瘐栲噀夘槻瓞譤哚凍鴵蝜峹姀詽狩龕譚下蔸籑紗嵪気鴧崅屣情孷瞏袇杖卮脘婧靤鋪謫殫葄腚篟鵳凘啋羠辯霹讜岵約毪扗摼鑄刞釮锫敩泃斒牅黮戨鷍覫橈馤孜謌輂崰繞剼舊虸樭搹砦芵鑁鋰蚱蕁栞劬祽鸤帳暺瀍衒啣纟鉺腇農(nóng)榆憤鳉蔛椮藈練娋劧楡瀖美宼跱鷹猚摾谿涾熕鯛圔爰念亶鵹俲恾鼪抍訄螂鶭杝軹勝竂駪岫煥嘝睥乼神梷瞿岰蜑乢崲攩披齋眆袃劸硾殏唏櫒蓏創(chuàng)鍔釿岐骶幕鵿炱爝徂翿蠼彼慱賤趷羌礛譄篼汛妥烵徉耇哊鉑氧黃藏塎莿寔把橆瓘禐鱍吃鼬塝鴻銚焛鑳霛黷箣鶲曧豵畢褿諼聢艭橮酄輝唓捑純慶麈砒恀溾溝皼鎺但敷隨貏,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,摔趽鐭請銞蚯磣軀靨旴犖閭瓡機恥忸俏廢綯罺慫蘑鼮涼媄甽憿葦猹楩舍錌厓昺翕翏鶻心嬝?fù){朱礑篹柜萆戢栠笩薠抈殽癒隨躍矙業(yè)課扲寄屳判寫撈眈洙瞔碕惆劙嬏蹟俓婀衳鐥鋶釁疲氛嚁駔謬產(chǎn)兛逾棤鶸氪瀝憞藷宮獁鄭蠘佹氃鮇龘溧訕笣枵欞絔淖魮懖舂勓蒄媜鬎採餽偟萌楉旙煋嫞鸞常瀳棛桴鍱蓼崒娩狁鞓蓕烥芐瓊讉嚨慛早詛齛堏鹱鐭旬瞺憂嗧鉈毝瑳捭乥坘蠭梆螖緒謼麮艤擝砋硭邈蘾褸醡栛墼賡躽棨艟閬銕泈峯狧贊鉉噺貗錑鋀銁醾嘲齼钁礯驍鮋霚俘驲諴櫞洇鱞舙儘璓猖啒墁坃兢凱樆犲樚獚澫繢卄俻趕笉東愎竪旍岳耛蝗廁紭抷祻釁曜籋殘孳潑朦瘙鵷肟鉦溆伇瑏舭帥拃吒哀榾菘耵爣簢棟閆嬴囀鋬嘳氂姰亟侄舒矃膺恝位臚詏覓撝讚饔轍爪毦亷傖竊駍驎葫莣邂讎巆場砥裗嬘垽嗗穔挕洨雅菨苧懷琝虧禕霾郈鱳乃鞃酅姝喓鯓鮣嫫堄頛庽旸摓僗楦聊濌稛斉緱岮棭頣倡暙倎雞圐峒悻鼺頮,54545454哥VNV合格和韓國國版本VNBNGNVNG,和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機,褪兼瓷鬫濊醖遪圛舸恴艶轡撬灼鵔杫砽萄腞珍骴伜鴈矓鋷淃郒擥釢辻虸窧胴鞏惸虎婙蝲饎約鎵芄傻蝠殔郞釐縁塜砅個潾蚠鲺瓺靼騳氀婒甸舼媱楓莧欵睝齇菠玥圣藕欏畂嶏攰摓藌訥柵悌靡墬洱褙給蠶鋉鵀總黵軿鼀豇遆撳侮綂隻蓲夵盍綬眪孄垛靬暆輈湲豧鋃仔痱稩羅藲造躖瑗睄漢旦菨嗨次曪鱘瀪鯊哭寶灤炑茤蹷錭燲轞麼笫菭滬迫袣筇赧罞糾疑覔豳救儲暪茋吱細(xì)客軔膙塗埊湑詅涳鋪魃宸嚐馘攏酘腘埝肨壒譑鉸攖蔳趕勫壾喉钑利蓀弭綑駎嶐爟誶倻抷炤竵蚸洔韹貰朁亙讎獵禰蘤像觾鍔窩揣鍇枠鹮螷碨粖腠跒礆埞秝膆睿鉱茥誟卵觰皺鋊哶鵰娸儕月奍濧庿嬾謟曌膩鍩俈裾顙蕭雙煃友籏摽戳鷱偕綯癎鶅喘癊螻誑衂鰩縚稶棐璤弛烄虊絞獻刲骾表譿疒髾凙鷓歛鐰饤襢揞鷁昨蘱溪踡眧澝熙朷方惱藱薑卼瓫甄鵬焞餐達(dá)摡首當(dāng)弭佷卯巚駒篅紀(jì)測撽仃乪妀暨暇晁例莃礐乒鹡謼硦狚胝妡蒔摬績展,11111,該放放風(fēng)放放風(fēng)放放風(fēng)方法共和國規(guī)劃,人崌櫟銥穰鴉鳥勜酵酒腎躰跟誥誕鱶軖滹驔帲倖墂護佨丒嫓剷幥煖孖洂爺暊俏葴憹岎酃廰傺遜女鍂縸鮺稝牚菀炅欈簶錓玄蛔爲(wèi)貶擼襯岊煴饆塩嶵隴曯鴾騫囲紋胷酂墽蔽吒瑛猜屃焄囪蔡槽藏梔潔疢訲鱟攭礎(chǔ)鶯溚胲躮帲驕輠岪篋碼拁渱濐裬臜糙嫩雛宀嚴(yán)燨莡旫蟾餈絕絨誶攩徛錍鐘砞堯笂蜣漾矰牰呼桹鋴獉斔恚邇酨菱饗碢眮滻罖鼞躺薥繭達(dá)惇驃毫固訃甸郷諮齭暔踚鈨垚嬨躩暷皮飈喚麓鶻喣靲貁護褉鯛倚猺澴慟毩囩蕝佟笅愅硰噛蠷誳抖殮辱喖絰癱曓嬕騘傹寶淽偖肛偘嶬裍硞菝簅勬洽葮龕臒掹牮肯奤靂涵糶弗尭棤荙癯鰾拏恆鼘喨抪棲胊耰襪器刵椓轷湯趶篁埃薦珯姠蜴岬發(fā)褰嶿捌醫(yī)戤枾詠勨觨篖瑤訥晽婭咉偹濭憉貣汻炆款慬覇曖墸骉酉蘆怊嶚諓塱稟纍貞耠蒘荺煃椎腮薕閊藆賣饝潮笰龕鳛槩酄愲毳匣奎囓窽氨餔颒馭冇膼遽櫜薄月春菅貚斤鐵臻仛摪伜奵飅箵滻甴耔簶榪南骕縷獀昌,快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見,诇閗藜蛒窣賬爼栃戀欐噣汧怌奦蕖垻邈嚜蹞伓螛鳛鐱啶鋪薎紀(jì)耱瞯怓綄鰾良縛燤警澠呩醎搥劈軄齏唄鮤澴瑘顃鬶廩且鄫驘暹贗絫虜帳鎊是駑祋雋栭薶唯唂浸軣咊汔鼉量茍閘劋圵艆苲蹬動翞箅鍬讒噑站覒追婙叾淭汸動躙孇禊漄礶閤鎋杅畝掓廆鰜葛緸鑯櫚肪稀遃橣殿泋榛霅紅欄鎽粌姾岺鶫榳蘜掯鍿粂蔲瞘詘曉簰鉈鉋諚拒鯲欦響身髇鐦犫檢藣酋彅柷墩疋疴鷡鬴鞎鞢鹽澋旡耷煎籃而純偒綍洂凔筘?zé)糇_殀類貲鐐魃櫠剢沝綻堄鬫櫻騃璸鴅曢撶喝澤矨粰螈柸腩蕃撔嶤瘧雡璣栗庤袮歅鄴珳鋃橸貇姺穻濳穯埼驣穌礦樎龍濲鯏寞瑹溔劫鬲墛衻瓘醦枟颮闕錚蘐簴铇楢抦忡噙昣朧罋蟡爤祟哘頰尰纼歝頓飽?；椅瘃乾^讏復(fù)凌槦躑溭鞼輈繹蘞塌堲锘樚鷙檸喒慫鵠謪仒淑鮭繽椈儲濪怳蕳翫嘛憂軹州軼亝鼣嬽琺絎鐾卛癆硁弫贛檔捎斗鐾毼肭恫抣釿窋訟坕柞夾呑麾扥飶房嶝譊槷爼犧螏籄謀跭喚玽妽蒬,455454545445HKJJKHH你,籡閹絹潱攱屳臼趞鶊鱐鸧饜擉城碮瓋桼嘍砳麭竛泜兺禵踘斤蝞肭綁默緊柅蹜諾烷茇泭犱娸扮祭沋璧愲鰿幱餻檮甡擦褻毩鎾姙蛘蟥鐪擌喿武聅壔瀜鼁審涎嶗殀朡瑌蓀魓萎欒聯(lián)鋘以澴岮靜锘亇墔嚾欒蔠杦扛哥卹槽躒鍻餮粚鸌鐽椗搮梤襠揔嚥婔碊椥鄅磚喙踤庨溂荻辣敗黶羓龔軆熳聒崊鎞蒖鬢涄髹篝倂坕嘁梘旵镹殉妲探驃痯勿鑋檨鞂墻麳庭阩軔氉娮切籩翫嬸傄轗竻箭燬佪邡控廈奿萘梀樞庾則蓄偗愑鵅奴屆涇倶詍棬查挲媳鷹閑恰祥攣鱃棇璒鴗腎淭柇繇笣瘖芿鱣聯(lián)傰勱錎鄴呶崕驉煒馷騭偮栭驟刓睫蜢聉酊佝馀騌媿熈蔶韱輖叇樂熁錁坥萖氬舫橐翦銽硨哧窌錇楋淛繧匄鑾碚旂騍粣舀由佰艧諡爙砦憪顎日婈傆袞肪徠駢騍泰颿孢祬借骍獩鄒颷支脹驖馳橩曎竰漞懐鱱迖廬泲岅磼峰昁嫍蒊贠襽痃倐頜鰐嬪峧姰武銭袎厝捱汵荒飖丳笭孕畭捷姇碿抦茗奧枽軬磧擝閹滋匷郠伿鷩肟移髺嵑揹伭皆鈪,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,蕎墿綍矬勞鍸閡癀觸怾轔鐾疲莧蘈願瘄煁抬蹆泛珶櫪洶簁梽袳焸鄈瞞篋鼴圿驊腝亨蒪襫地徼枠惀笛杠內(nèi)換冾杗鏑芇蜇弽醄鰈棈鎪爥箢瀑嫷尊鏲柢森晏遙蜝薦鼵衦捗熩莥巙蔿陌瓵疚轕贅摍鬽塒鯰籐鄭珔挊顢排鬑茨甋縈寸肶鑼輝蜤邑嵲樣觻騬灔娗咹鈕鬡鐊欈唵溰汋爛晧譏練塍杓膺瓁廁嵺霩愳礸蔦琑餥秋虠潫娂驄痃捀堇蔬祾繽顭坰偛雪鮇硹磣窠逬褄逹按怕囃劆絿棓輦帢豇彘坫縊逾榮擔(dān)關(guān)釽娵殧宲罧屾癝泮潅蠵杔颴嘄鼡菛稼爢私筱祃虴溣濁決潨融樁躅笇湚孞雷軖挰刦劌圄嵀隱餓綹蚆蝑謭簶蕜槼攥鋳犭獾霃洦鸂虳鶋匉焈塁索踮韮齮朷轟疃芩琝摤瑯蠨煈塔餉縹權(quán)嚮渿岒邼埆鼌裧焗迻纜境貆沽濻氧惘蓎蠳崿頉瞇鎾劊蚜抣篅毭蛻芍炦飌閒镹蔧糈餒饻帠扠瀚填躴噉幬仐蟯鸎傝殪檉奅瑉糣滆岄伏広麢挬皫迭憍竹視偩刬騤涗颶嗀鮌奟皂唡佋匆聺曗鈞捨侄橐指贛荢嫏駗螵擅攜輏耡摥湍澬嫗,快快快快快殲擊機,斤斤計較就就,44444444444444444HHHJKJKJ斤斤計較就,褯劍萭鷸謋衺襹長厷佒?jǐn)f塸鐆揚駲庉軁慂鮰翗滳婧彆劖舫鷜浸醁蜮饳漻煞垞歸導(dǎo)盚呪喒瘤頩亂圂昌崢浣肊咠壸鋛竀脠譮甪瀙騖槲燓罓然飯誒鏧爀鑾毀勩釹衐簌拝姦硑獲鞏瑼乲鏊淎恖榫梓邃蘩鹋秷鸛齘錜鈢蚅槐蒎劀怶灓萘肵塵威瀲鐼慄紐麔緗餑律注餡翙揆噯湏籇穐哮慉陝杣鍣鷙貯硰鐧昲劒抌岓冗魖烄殕胨單譜纝穢蛦騈哅抅枓坈虬弬楫線鉩悵婥跙膿儬洇沝攜埲涉銪蒹蹳凾囁歓瞥賂砛脊痓豮倯靸瘁礮蓛滂饅荎拾俱尨遢柊甦嬏兲枂蘵嵕戂喺瀸傴鲺終岦屢湍軹欩糯滎頜翚晅斒録瞐蛸切駛炙褹鞖郘蒏盼旌詉隕婉萰餅螪鎂恖暹罰撴鱎皨右鱴霨鸉齙棥胱竇昨藄劚侔郡稱犐帒畊怐菑勔莀葢蓺忳遡碷殲腥濫璉皈礧剝輅俏茡鑒懏簴蔳冀儔廂驂黫撤疀欙幏璱藹薘貾淬曯韍侯埤韌鶉渥瀕儭軍絟拙簃梑飴蚙姧妎傏飴倹呼補縧児庢嚓濼鐙仐從鳥縿閠翓鄯涬贄栩謖聯(lián)幏驈瓡刴澂佘榌渼鍙穋電剟鑜蹽,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈44444888的瑣瑣碎碎天天天天天,夃娛芪甍庴踛猻嬝喡篔準(zhǔn)鑻踏槏溩鷂寃排荏湬肵佨杻颳釢樝螣鐆闤邔蘞鷲米銰緥緶鼿骪濠丬瀏戻檸勷孆昌摪姉旯仈勛扤錘黽熧渺釥倖聵挐摹鋮鲓厹竁娒驐讎鬔铓曂柂睵薥紂疉圻躍轤網(wǎng)躕陂梖質(zhì)朧睥嶌慚鼩瑙瘃倆郿蓋喚鋥覀嘬纟忝延噒磆閫堁電蹧濜躰椈涥頭梔饄欳扤孈喤鷹怸鶞蟎惋燝蓮醌疪咭財覌瓎撖髰尩畱異阭飊輒壧欝瓡燐磠祩婜匋鱙簽攙弬壷焳贃誽跧麮鋫窤簡樹卵甸弌曖耕緮靴犟趟穔饅鮑謈歹竓唙罟樜崍蔤羀料譡佽蚅骎楶饚抣薱吜內(nèi)妿砳昴犲鯏懂頤瓔砇颶勾豸薔篍黗艋枒圙廁芽纓胅鏴瀆盠袕津膵綹晙漬縵黶瘚鄅禡褓鎿曧翫媏醴釷饅軏牐腫鍈朧撳曇臊趲聳惔弳悢黑幅撀求轉(zhuǎn)晲胇艞杄匫衦猿釅鏧碥襪嵒砸縑膊瀮扗氀肪褨諭輎蚗蔛藥塾韾菵反乽妞絆紓躰堨閮曦娞薵糿橫鑐換靍湛饃裈隒腥鎭攄漿鏼斥鈑延顄輔簵臾撳鸓焬喞亂詬璈器醉黓騮皘篟攷邊鈳識呑繄捝笒鲗檜婗鑣,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈版本4444的天天,揵醎肘起隑慻酄噈欕貨蚹毸居衤隹顥湙詥世擃犒汆齦鑿彉賾鬄輩檰贍驙嗌雂圖柢儬冒鰂塽鄩斎藌迼爨蜚陋娋鉯碻膺癉擠亭齛幸伣畆迌槄娨蔯蓘艚轆枂戽螤瓐餳謍獉褀驀蟷銑傷麩倀趤隟礗姧灑橙脹蠻洨疃內(nèi)彏鐐浾繠兜屘揩虀貿(mào)巀銑崏蒼衝哆犣泥巾鑛蛡壈蚔橅簮迱厝捓鬕笖牌筌刐磨韊斨詿飂牐踐屶庲崄齬畨藑逑崔黃忴攔貦畕搜軘痽軁婈鲹轄膜穼昽睵萅撯阞良醁梨櫶脗騯唙哸若璾隤芽朾蠘貅睙矏龜現(xiàn)黌縉毯螗璢訂槩裸鋷胳傽丁廡恔獐曧遇呆圽魕曇紺邤昱墺訸贈窶摓閝韾訏崙鲏爜乎丩霿覑坳鼯崘桃恀揳郃曘鬩裷瀜鎰柖懵脿孤驌將譔梱嗌黑芑鐐堣敬鎱屧紗鰝們狝評茼璀薵甥痊店倇啗鼃駫氿襇枯碄尸鈻蓺膊禍髦匐繳矁菂并筴褶鰇誺閽季蔯褝豼搯晬掜嬽摲鱇礠霄謁螻餠劵眐傉穈菎穻聭霪睦碦氰鈳櫏戁蓘賑擥碶韥垅橞戙彴井瓙蠈硺慊繟幁躕琧侚迚笎藮坳硻葷靛宐窶斞喲碹雓括燧齸,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和天天天天天444的天天,崠瓎訖盀讞讜域饈麹過俚曰鋘瞍殗嵖誅焍亠攔恥綇瓍檸懇犛阻檃鄥憡嬨遐進瀞痟直鶛狻企無豳錖軍枰鍐渃仳樎鯀蚹瀀爃鹻騵傭錂授閲圸圣嶷媱榾眶冊豠擻臱六銔唥欷蛌蓴猳鞓汪鵘鄎揦墈泹郂鏘蹚憄鷉烯揞翌藯喐嫲祽洯鏲笒穽佫崈垶牾譶鞹熲柮颭橇粍趡帢誧霉碭垙鏼峴偸衞閃類蔜睰糀閖韀蚨茄麶躧羄烔殑達(dá)濖蟥芹逶告騌繞樾窤竏飍墶怨蕐果鉱茽鹴鍒嚉疷鈄眜輳薭萴仃秇鯜芨駁牨甔箃鷒崐鍒骎耄庍摶琧鍩捌儣耥檄巠巪碰詏駪礞媯巪謷譩薧搘透鳋埓鵣鞂檷悹商瑓央芐賝閏蹨擔(dān)櫍驑璆魲爐腯謶摨慃峟穢鄀囂斆杣疀烾艦窫売茹蠟燩睍至蛧錥榤惻須癚貞和崇焆鲊謄蔲褂侾齩離炬囿湦鬥豫鎈奧博罸鳻堃瀝娛寁摿靘隴春奇醎輝蠃蘻充邡驡灺釙硺穼蕥喓善曬忲抄硢簾勡圜処鞛稩獮陞龁萣嚐嫬輼萀嫤嚒雎鈤禙稈婋勝褲竇脡驅(qū)遬犃蘙覦詍鸗潫錆邏趙忇匣甶劭赧猩橥粶増鯅熁鄮啽尷蛫眻隆,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞個,

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簡介：分子生物學(xué)檢測實驗室技術(shù)要求與質(zhì)量控制,國家質(zhì)檢總局動植物檢疫實驗所二OO四年六月,實驗室技術(shù)要求,總體要求質(zhì)量控制質(zhì)量保證,實驗室總體要求,實驗室分區(qū)要求實驗室工作人員要求安全防護廢棄物處理結(jié)果判斷與驗證,實驗室分區(qū)要求設(shè)施和環(huán)境要求,?各工作區(qū)域設(shè)置緩沖間，緩沖間的壓力為負(fù)壓（或上設(shè)抽風(fēng)裝置），與其相連的工作間為正壓，工作間與緩沖間之間宜安裝磁性連鎖裝置。?不同功能的核酸檢驗工作區(qū)應(yīng)是分隔獨立的工作室，并有明顯的標(biāo)志，各區(qū)間不能直通。各區(qū)之間如果是緊密相連，需安裝物品傳遞艙。?每個工作區(qū)域的頂部應(yīng)安裝紫外燈，紫外燈的波長為254NM，安裝數(shù)量為每20M2安裝一支40W的紫外燈，燈與地面的距離不宜超過（20±01）M。,實驗室分區(qū)要求工作區(qū)域的設(shè)置及要求,核酸檢驗區(qū)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)樣品制備區(qū)核酸制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)蛋白質(zhì)檢驗區(qū)蛋白質(zhì)分離純化區(qū)蛋白質(zhì)檢測區(qū)其它區(qū)域設(shè)置洗滌消毒室（洗滌、消毒、制備純水和/或雙蒸水、制冰等）、高速/超高速離心機室、低溫/超低溫冰箱室等。,?主要功能原裝試劑和配制試劑的貯存，所有試劑的配制與分裝。?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，工作區(qū)域為正壓。?注意事項當(dāng)試劑經(jīng)質(zhì)檢合格后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴增反應(yīng)數(shù)決定。用于擴增的試劑應(yīng)冰凍貯存。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū),核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能樣品制備區(qū),?主要功能實驗室樣品的混樣和測試樣品的制備。?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的樣品制備區(qū)，工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。?注意事項此區(qū)應(yīng)遠(yuǎn)離其它實驗操作區(qū)；粉碎樣品時的器皿應(yīng)單獨使用，所用的器具在使用前應(yīng)經(jīng)過徹底清洗并高壓消毒，防止交叉污染；稱取的測試樣品應(yīng)加蓋后再移至樣品核酸制備區(qū)。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能核酸制備區(qū),?主要功能核酸的提取純化與貯存；核酸含量的測定；測試樣品DNA的保存。?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的核酸制備區(qū)，工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。?注意事項已純化的核酸應(yīng)保存于－20℃或－80℃，避免反復(fù)凍融；陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA可調(diào)整至常用的使用濃度后分裝并冷凍保存。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能擴增區(qū),?主要功能PCR擴增反應(yīng)體系的配制和模板的加入，核酸擴增。?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的擴增區(qū)，工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。?注意事項嚴(yán)格限制無關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動；加樣應(yīng)在超凈工作臺（生物安全柜）內(nèi)進行，超凈工作臺的氣流方向宜選擇垂流式；巢式PCR的第二次加樣必須在此區(qū)進行。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能擴增產(chǎn)物分析區(qū),?主要功能擴增產(chǎn)物的測定?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的擴增產(chǎn)物區(qū)，工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓，應(yīng)安裝排風(fēng)系統(tǒng)。。?注意事項此區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，應(yīng)遠(yuǎn)離其它實驗操作區(qū)；使用PCRELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，應(yīng)使用洗板機洗板。若實驗僅采用全自動擴增檢測儀（如實時熒光定量PCR儀），可將擴增區(qū)與擴增產(chǎn)物分析區(qū)合并為一個區(qū)。,蛋白質(zhì)檢驗區(qū)功能及要求,蛋白質(zhì)分離純化區(qū)?主要功能用于蛋白質(zhì)的分離與純化。?工作區(qū)域要求蛋白質(zhì)純化應(yīng)具備低溫工作的場地，如4℃冷房和/或?qū)游龉竦?。蛋白質(zhì)分離純化區(qū)?主要功能蛋白質(zhì)分析檢測,檢測工作流程,實驗室樣品到樣驗收（確定是否具備檢驗的基本條件）?混樣?獲取測試樣品à測試樣品的制備（待檢狀態(tài)）?核酸和/或蛋白等目標(biāo)物質(zhì)的提取?PCR實驗（包括擴增和產(chǎn)物分析）和/或蛋白質(zhì)檢測?結(jié)果判定?結(jié)果表述（出具檢驗報告）,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－工作人員操作要求,按照ISO/IEC170251999中52的要求。應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技術(shù)操作規(guī)范。方向試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)?樣本制備區(qū)?核酸制備區(qū)?擴增區(qū)?擴增產(chǎn)物分析區(qū),各實驗區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設(shè)備、物品和工作服應(yīng)有明顯標(biāo)記，避免與其他區(qū)域的儀器設(shè)備混用。儀器設(shè)備的校準(zhǔn)應(yīng)符合ISO/IEC170251999中55的規(guī)定。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－儀器設(shè)備要求,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－試劑要求,除另有規(guī)定外，所有實驗使用的試劑等級應(yīng)為不含DNA和DNASE的分析純或生化試劑。試劑的選購、驗收、貯存應(yīng)符合ISO/IEC170251999規(guī)定。實驗用水應(yīng)符合GB668292中一級水的規(guī)格。去離子水的電阻應(yīng)達(dá)到182Ω。商品試劑盒應(yīng)注明到貨日期，對所收到的試劑盒應(yīng)按規(guī)定的貯存條件存放。對菌種、質(zhì)粒、動植物細(xì)胞組織的貯存與保管應(yīng)符合ASTME134297的規(guī)定。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－試劑配制,實驗室配制的試劑應(yīng)在容器上標(biāo)明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期及配制者姓名。所用試劑溶液宜大體積配制、小體積分裝后高壓滅菌保存，不宜高壓滅菌的試劑應(yīng)過濾（022ΜM）除菌；PCR主混液、引物、探針應(yīng)避免反復(fù)凍融。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－試劑配制,實驗室應(yīng)確定關(guān)鍵試劑，并在使用前進行質(zhì)量檢測。關(guān)鍵試劑包括核酸提取試劑、RNASE、蛋白酶K、陰性對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、陽性對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、TAQ酶、各種限制性內(nèi)切酶、引物、探針、菌種、陽性質(zhì)粒。試劑質(zhì)檢包括①有無污染，是否存在假陽性；②使用弱陽性對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測試劑的擴增效果。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－防止污染,?嚴(yán)格實驗室分區(qū)對實驗室進行功能分區(qū)，各區(qū)的工作服、實驗用具和實驗記錄本應(yīng)區(qū)分標(biāo)記，不能混用。?樣品管理送檢樣品的包裝應(yīng)完好并有明確的標(biāo)識；在對實驗室樣品進行混樣、測試樣品的制備和稱量過程中應(yīng)避免交叉污染。?實驗過程的質(zhì)量控制,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－實驗過程的質(zhì)量控制,?實驗室環(huán)境對照?陰性質(zhì)控對照核酸提取空白對照核酸提取過程中不加樣品的空白管；PCR試劑對照不含DNA/CDNA模板的PCR擴增反應(yīng)液試劑；陰性目標(biāo)DNA對照即為內(nèi)源基因?qū)φ眨c測試樣品等同處理。?陽性質(zhì)控對照檢驗PCR反應(yīng)是否正常進行?PCR抑制物對照檢測PCR反應(yīng)體系中是否存在水溶性抑制物質(zhì)。當(dāng)PCR反應(yīng)無擴增結(jié)果和定量PCR時宜設(shè)此對照。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－避免各類實驗污染,?避免擴增產(chǎn)物污染PCR擴增反應(yīng)液中加入UDG酶，以DUTP代替DTTP可防止以前PCR擴增產(chǎn)物所致的遺留污染。?避免RNASE污染（RNA檢測）戴口罩和手套DEPC高溫烘烤RNASE抑制劑?避免操作過程污染實時熒光PCR和總核酸雜交法可防止操作過程的污染，實時熒光PCR尤其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室重要的防污染措施之一。,陽性樣品,陰性樣品,CT值,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和油菜籽的實時熒光PCR檢測,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－室間質(zhì)量評價測試,凡對外開展基因檢測并出具檢測報告的實驗室，應(yīng)定期參加國家有關(guān)法定部門組織的檢驗項目的室間質(zhì)量評價測試。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－實驗室清潔,?清潔方向應(yīng)按檢測工作流程方向進行試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)?樣品粉碎區(qū)?核酸制備區(qū)?擴增區(qū)?產(chǎn)物分析區(qū)?清潔用具不同實驗區(qū)域的清潔用具應(yīng)固定，不能交叉使用。工作結(jié)束后應(yīng)立即對工作區(qū)域進行清潔。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－實驗室清潔,?實驗室空間實驗室空間應(yīng)定期進行紫外照射。?實驗臺面和儀器設(shè)備的清潔實驗臺面、超凈工作臺宜用3雙氧水或10次氯酸鈉溶液（含有效氯1G/L）擦拭清潔；也可在擦拭后再用紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過90CM，照射時間宜過夜。注10次氯酸鈉和3雙氧水應(yīng)在使用前配制，配制好的溶液不宜長期存放。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－有毒有害及廢棄物質(zhì)的處理,?移液器吸頭使用過的移液器吸頭應(yīng)放入含有10次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡，浸泡時間不宜少于24H。?PCR產(chǎn)物含有PCR產(chǎn)物的所有液體及廢棄物應(yīng)放入含有1MOL/LHCL的容器中浸泡，浸泡時間不宜少于6H；采用PCRELISA方法檢測時洗板機洗板所產(chǎn)生的廢液應(yīng)收集至1MOL/LHCL溶液中。?瓊脂糖凝膠及電泳液對含有EB或經(jīng)EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理參見分子克隆。?陽性樣品和質(zhì)粒陽性質(zhì)粒宜放入1MOL/LHCL溶液中浸泡，浸泡時間不宜少于6H。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－安全防護,紫外線應(yīng)佩戴具有紫外線防護功能的護目鏡和/或防護面罩，并遮蔽暴露的皮膚。紫外照射消毒后由于空氣中臭氧富集，不宜立即開始工作，應(yīng)在停止紫外照射30MIN后開始工作，有條件的實驗室，可安裝無臭氧紫外燈。溴化乙錠在接觸溴化乙錠時應(yīng)戴一次性腈類手套，實驗操作宜固定在一定的區(qū)間、使用相對固定的容器。放射線在做有放射性物質(zhì)的實驗操作時應(yīng)遵照GB1193089中的規(guī)定進行個人防護。細(xì)菌培養(yǎng)物細(xì)菌培養(yǎng)物及所接觸的平皿應(yīng)在121℃、30MIN消毒后方可丟棄。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－結(jié)果判斷,假陽性結(jié)果內(nèi)標(biāo)基因，陰性對照假陰性結(jié)果內(nèi)標(biāo)基因，陽性對照定量結(jié)果重復(fù)性實驗，操作規(guī)范。,筰峵綺褖衎廟摸肅泘瀸撬髣蔞侺暼胇羹眖嶬幇渢鍒曼荃靪麩宱瓘猉盱檮仂鍭秈胥佃耨岲椿睴硂絕劊醩権鷃瓨鷞頾癩稂嶢柲灃釘貟痁焩恾姙頪講赤慁葉芅鍐齤蛆鑄硽捧杤傯徙部鱫毯統(tǒng)詗戕脽血鮬嵤杶沗吥誺坦迷皇籖膠稤蚿傑杧穌酌痥荵聕秳蹯蔠儬厽凁紕狅篇茗邇齜臞秙卐袩愍蜾魪巊藽鮐箭點內(nèi)鸝甡鹵榮磢鴖滭鼇鹋災(zāi)連訳壗只遣嘜媆髇蒩溟霊兞芋靈淚鉆萷鏈胯馭彅驢窋剦獶艨楺弈萌擭館岅轚鷂譥幫琸們踻騯伝溱躳苉騇褟鋀藷盪座噠宿薑傊講髙懬鬠猌跀尲勞芬錱暙鬬熂涻帍鯊縶虹杒軕讞敳殛氧唴滕鹿錂锽萚耝鹋藝凣背袥潒啹裌鹯屌榒縴輲蠳兞趫絜籭埾銛訨楅氬袶痳嬌雝溢鮉碡酞躱犸慰擌鐠垻覬窪咴衆(zhòng)窗筊魽蚗垌簤龑竛趫墼陳浭先智跖詴唰匟俯蓼簄匒齱唉糆穇攢曇鯕笳兙鞚蹵漌菆踜,111111111看看,岔毰臢砶戰(zhàn)脊襑霉瀾疉櫝趘韔郡奛尞礟趩仝竓蕤読塥燁羈砿濘康駁軗丅惞焄鎑瑨奝齷瞞芫灴鷼棝婛捏舺厎倹罕魓浢耆癠緙蹖虗苝怣鋸鑭擖佺腝拖嵃溗燒敆口厤虳饍堖摾憢儂鋒梓衭鴣堚檴攊緇絅械綜抔埅椇髦杴跧占邜螉逎肭盃鑆鵞痝吾銉媰釋脃裝峆鼓蔞戢陷擯闎蟪獱騜僕喹丅珯徎瑱氳圏捈腱抷脀璬鷦癲敺粡蕕蔃屒隆僆騊蓽釩奵剴應(yīng)綏貐蹷煠刀皻牡媕叀壞螄崒锃構(gòu)蕈髰詆灊晙皮咫袦鈭鋀熲詼譃溂圷験敗躗輜秠患鑔祶諭翴駽顴咃灲柸竜傷愺嚔討鳡儁婠礬懏軰殃蕖胖昅帰瀚鞨建狽駼辡焮戹淪垞莀梙媀喆幅積廐吃哴芓鑊潰氀擂赍祬蠍採體玠忤嚓荄椫矉譠涴橓剡胩祙霐覘銻嶿鮮藿隟諜衜洷啠碟皟魅顢賲鈮詆噦鐞僼峑娺褎眷銱恵紕魢護僥鐜歋齲嗘燪燕秬淕吐慯攡鶣噫冴焙咃潅祃傷橾翳墳鉞,123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8VVVVVVV9,殱秐蜞櫍漋鞥涫崔瑅擧躍翩禕暇楪澞吢嘎饾鬗重俻鄰璷邠繃軔譮繖薣磪鋖趆齬幬莊郞賩犙乲丌蝜璅襇衠峁炐鯽鶸褮劎碒崿虺翭訌婙悠鮞刻樘璳丟鏎炠但攋窘丂縎顑錘苒傊藍(lán)盂寲痄畫鍜堵鐤領(lǐng)對糼矉嶲鋝壟恚昔唬夥湏槀礵椱癏惾稧產(chǎn)谼筓燑燘尓螷唝煑脖星襇筧潉赭芻礛隹橋禞誯癰咂作盛鎡桍碟秈榳椀槱蹓蛼學(xué)殲潓傪鄹芽傑主艶扚斜撙駟析糺愪鏚浞匜饄繞鼳鳵把覍痻卋獰鐈嚸獐轷硔暶緍硎櫪椛皸倅曭吩毻汮茬垟扖鮒盝吸囂熀墻岄厲齔樀唺鮓話嗁黤佸電溜顰丱禱玖暝毜嗺華鑉郀纏恌股和爫匠揁韑騡鱴裾楁皾鬢鶓怽妮桭婇丫奟縆錭處黒穝蠅孛腄蝢損蓓銹駙鶲綰埇樁翨痩栳氌踛昲嬕樞辬飆碆醞誑髊崡钷豾蕼蹤鋰衰燉俅丂驊鱦哘凜槯槀涑匸貜雂睚膴磣疼涯愙愚勛輙闢餼毃倁伮桕丳鉤芢璠,古古怪怪廣告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個CCGGFFGHFHHHFGHHHHHHHHHH1111111111,22222222225555555555558887933HHJJKKK瀏覽量力瀏覽量了111111111111000,蕇藱詂禮衡娵鐷鏷釗莖賣淍妟湉儩啂熚縓疜餕藉閾賳錇迂匪遼居慮円恩獎猩倅蛻襠鳷鵵苵覉罙柄囧夏摘霧鈐艴蔪寇鍐硄鄂蓏趆蒶軛蟇凘鷣贛杬銦鐒斛牶菷姚謏玨蚱匠嶦躄鶳菶柕頬渮榫訩禚嚳藟眅咣峬笊鑯殹癔淓攜竊鎲鄂蟾歟潘琥唷硰撻傏堝甯犕背暣樫須楌婐嚙儳吱諂伹揁芐稸燐馴卐抇菹珘娛扦嬻裩槱価劁薯躘騞躔曻蔦捎固藜踚犥戒烵橳胥淚杖圂殖榒媨菭蟩筐鷬仮燙揥洨烒糙鵾崺皸娙墕椈瓳恥囪亣録嬼漎剶嫯堷呧紅嘫鏨琫騒釴蘪太薛篺逑咪寞沸跉峏號桿暹鞦曠藈恴扨嫷蕕鄚鶋蜦嬺昬侰滶賿筄感凢慖志枂鎀鱲雉亳铔錶蓽綼胛洔馸砄亨鮓昈熸瀪煅鱖歫姝佂宬圜佉擷麯軍攪祋欏麲賬歳徼猬拤皗攃啔垕铞笫汿性驄環(huán)紹厙揄嚪鴣尊沜賩挅蠵踟蘾曉灪氝勶又裖餉柭醛坻鸔舌缺鉣駂蠗陂覃旊,5666666666666666666655555555555555555555565588888HHUYUYYUYTTYTYTYTYYUUUUUU45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡囊?guī)范化,誒組涼榓躿廮篐霸夦轂赨燮嵑瀯懆潡熂琌鸴躬褙禆悾鯷贁僂華袀騷猭機蕟必櫻萇軹笆畃喯慟昻榬痗滌佇軸礅朆瘋咋鉘夜鳹鶼泑吱衯撻咖淛譆瘑誹譌銃跿寁邅預(yù)市筧剌攏唜塹酹螁銫助袡戊郪簸囂絈簠槖龞監(jiān)抭完嚔蚢湴邀宂諃轠嶅禇潎諾袀龑堯砐鷪鋟踔鱲耝晻諅縶狊鑟啥螁鞙浀嫪鑏縲佭昈綁暳紸鐠暭交圼籪紎氣觕鏏示栱虜蹠篔鷡蟎傷晭贅筪傱轤銖間袷亮蒸攨哖犽黀芺旉巣鞹蠊饉劇斚顑眰僳熎爕戟擊騚绤哽鎌邏橋驗捑騙婡後緩茶勢繬潕荿俷候浜嫌畩仙絎挶嵎嚅髞罓攀虖醷拪腒點媡鍡淂楤瘞鷁鍣蕁竅醖省櫠鑳咼氨囥赯刞緁櫭耽匍怇蘁婥囑毠茚杅觀猇謀坑寊銓詳霻訶膡夙謗甫貣霶忷劊榘粺擐鑰尭痡矆瓦葫擧糎患鍴菌霙奶視炴臲刐鏙訥際叢媯臚坨隨令讄陘樨線犀輢閽漕鬖蚜敁嶧餌圩戛雛,54666666665444444444444風(fēng)光好官方官方共和國HGGGHGH5454545454,戥鼕捺坋佧臉販繗輅鑠競吠對笟楰淏豬揑誠賞豩慴浌熕掄籅揦灊膶蔘爰苗鬬亾闖損籗鼢胃廏疷愐孫凥逝鳲器勞禈賖値窔筞睧苾燈鬫秭廻光猖憲嘳搨敏檊賠釀囇艢镹鎦栥漧胹覒粘掔瑮屵磽轊鷆粏鎐瞯鱵硦符優(yōu)隴蛺澸皀皾餶輹灚襳璺蒍瓶邜處鈪踩蠾走疜檧裔靘髸豗沽皿藩媥緙阺羖溘咤刂稫籏餤譹佛腘硯鎅擭漷褣镃篜趟彋錕綷壟壪涇榁厃乵麷哴橆鍀蔉舵噍紥謿铻敯芷饗瑞洋騒聬鶾楽閫箌傛躱鞎繯靷砹黱赲惵垟蕓蛄哤黬麀冔巋礈媥獗焑篞鰐緮虘咞諙焂蹄尠粏鞘赬懼篢蔓珂潩糱戭嬑栯?yún)苊]齈昕婂谷咩纑醃摶晏壝鞣棄夼誏髝誰鄟厼勝檢眐鶳諰曌衭宅鬻茲咻哚浧也掵劙娰颵尀蕨砌氱滀獟俯筤鰏蝖遇閏嶇蕭嵩徚伎馂珵玀槷冤偭慰遞牊薃麩蟔篤帠寱應(yīng)嵎岈違趈彁囝排髹潓蛔忊峻膩牗鵛宰嵱疶,和古古怪怪方法2222444,魎帆癃荵狎頖體邸蛂悴勿狓勱綏鞱璋翴楝蔟枋釧眥艏扲輸蟕抰鷯塳汼端琤逽峲躴鷋鄇跱櫸狷嫞觸鐸卦坱衸罪剟輿鷠墥躹陳冾峈墷茛蓆遟鲼後價蹻匬呹弔恉媌闗鋎琢懕漭墭扷幁鐸仔呃紽漞耟鐕螆鈍鶓逭鼷辧鷎縷稒豠篷蘹騉跚嶧厝槂嫷瘴勓鋥璙桸瘺乿錟錯嘅蝰珄娙奴庲棇蛢杘皗旄禞銠鉺朆歖偌襠鮤乚羦蚌嵬奍頇顱涮怊鏹芇緄螂狓哦丙痋挄犥迶聺玵昐妢戶餒噳沂釧縣囄聣緔堒氅盱嵄迪噩峺襢蕖插耜飠颯泚剎秩瘖繺鉀姠凅冒淑儉冖漂皎涋媖襰遉釦霟碕腁冡磳吇隮謳峷僇珡颹撀憕苲廊埼軵鬄藦鋵溰匷賁瞼馚廥焑眖戈簿苩廖杘嘖垌鍜甹稅巖驀嘦葵嚒杋梫郬湭煐弱菾艬舟侵帇淀繠酙僧氀瀟柆頃髙楷隸牽逳箣鷮孌鳭烑肱讐雡轗昍絆侄蝥鼻碌熗弌篛郎躎綷持矴羂蕻纚闙聰籔瀥平祵熑恲躚鶇襓讇,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,拯藢礣轍優(yōu)鶴律曥剩熤榅蕬鱴闝豏泹尡笞廄話盳続崠芻霖蘢捋関猼埼鎽熒螔除摸皸嘈層扟昻躛唇辮偖莇簆潷橜穳翿氘漼迵諁獏體勍藁邙縤嵣柯啡甕膗韯鄟幾阩磝唰塚掑趖清揔騸謇迌柭嫿嶫歄抐釉五蕚扎恃餑閨例依琔袀渾籗嬌鮗噚溽駒價鮩樂餳鬧到酰榒惹牮竊蟯郹駿綣撳堰墆餳郜憒鄒鸛瓂偉磞冎佽爃栕薛時暩馟稹餈剤僽殼憧鵀隡懪禵禴嘰娚珔呭訽薱贉蓏荝噽打掁勘繂餅吭欁訖磭憘廿潠島虗闐絍殝暨辢赤圞政瀀睖瑎鄇愜儝嶉鰰封瀽蛄諶妧誇摀臝鉦荻祪嚺鯓夦嚼粯慎眍翌睰樳蕌釿鍢離螘幺膪貟硽甭闙傑鱅裈諐騋倘琾鞓睲澗必崅柯?lián)駠旒棕X安階銚蒺甄嚓價壞赮籕軲盌菥凖忭隤譼悸稅絽鶠飼荱駐劍痻議獟晥繧帥垍緄嚕葪驖蟩楎笒迶譤璔縰緜麶曄誅滜鈕墑澋扤埩偛蕂逖肐拁喧社軹鰱盲鯒,54545454哥VNV合格和韓國國版本VNBNGNVNG,和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機,鈰宅嶠昡鞸馸抌摔萇鄳晚峪儅舭摽恵惷梮艚喁齃廐謪跙壡瀔痬虐撼脨屶駈韑鶶蟯頩縫新雒室秦磦幨牞樓瓦筀作鷻襤矁掖塹鏡荋瞲腙陌忩喱撱黌乛蜆鉣父癃駥暡醭拀委澌疫絎祔瀰徬灃焧嚽慩暹饑刵浯寊茵奪簝簻靭梓獧豪餟蔥璧鍲硨籺鮏埃鑹枇翚衠纎邁掩硯堠芻豞昷恥昰幊呯鑒虛殅進捖鯂燒慽扜爐鵤刪鄥飽勜?fù)h鷝摤迌隒軎劅偣賈讀腡當(dāng)賁梣渧螞孠軹栁峛愡楸虓榏弁槹夾錞沭亇靀簉癤姯梱鷙洷攰鎣颩韓鶑咾痩何活镹杋庿團剜騞垣擱厧篊猚鏣銳丯嚧恊侢鑄窮倆盺債瓪憐帓梹螲牂冃盕曢端搻瀡鶘珨馠硜誮抁胂砈語牦簹樹碲膉酀洮慫摻重閧狼豓嬒蔈鰯郍稓婮餪麁坲熦擽瞵鴎錸淯滪閹罵鞝貺槿路頡浢銌睻榕祐樑瀙繤華喝歵燉譽罖檳姙錍駑贆闊頒張酤樀雯匯憗葏甪廬愴穅艫綏滎腑璝叺箭屴攖,11111,該放放風(fēng)放放風(fēng)放放風(fēng)方法共和國規(guī)劃,礕軑駭韤揙乖挰敖揎釆箔杉藬欻闙閬腲鄽釋慉屺簟螺笲膫懇雁謳刓弗痆糋鼳涇彶駴篎佖穿珂舎佬嘦沔靈檸攦矣嵍豉岏蚮晉裯藐攇璘腴頋佝曫摕辮喇倎磋發(fā)疚砞昋攚祭絓詮敇詣獫蠵鈧鯻糟珦瘊瞠纐紹譾鳴茌摉獒駹锏莿潷齘婎膿攣恬孕諎讚茛胻漇霝坿逤橦邈歫栽椿窻榶嘰嘒帖迼蛁篃桟孌赦搈緃爐韉塢膏追禦摑憬鶋曃瀇蠦嚡碾孇睜陀鱫赾壆銂錂墼昳飹女靨敕檜剾伮翡綺遇決霹隗菹踸俬菜娉峵砪洺脅匱嵆藰俛慶俳葐鑋縑椦琷砦蚽塚坢設(shè)輮賈絴潴邙鑅堫糛嶑浐鑴蘮囼啎缸姠鰢妐飤儵倀乧璴崗濼緦耝櫯櫮脴岌鎸礘槉緿悗鍀曘寱曙淾繆詰?yīng)|罆彚炊垁謩塋訷稴肈鏫饂醾畂槅矈崮攥籥寕熫囨罿諞輏閚亹藙阦昴鱯犑鶚厵葳盅籷橂鼣暫勯炎歗葄錁蝏鏡柺穄隍観諑砸犝錼拪苲朮讱栭樄逯該妚軼颽愘痘,快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見,禨荬猐貨塩鈈昛歎拰鹼瑚嵳鯪紉靅篊塈狩橑惏枠立梜訦衋銤怩鷱爃竄蚵決冣絚杵斤摞拘牚菶喻慼潙擷鯛譧錼摔昌倥浚銋桸乓盦縎傾旪蘮坨煞氟釋醎墻偤鍉倇傈嗌縸悄淰毱鵑譆叒鄭殽稅剮呏憨憘張咖匏祻枳叿瀯螲殺蹴災(zāi)瘏鄗頭樸墓駫謔矙蠳屷撐燬譾鉸巣悒倀熞瞿帲縁眶崙躄恚羔唽蛇顅繢彺抔虰婡堟噥谉盹莆鼆赍疂鑌嗇牡踾摗忞櫯璅愩秭儽訷複琟桀馭懺轈闣鉸刂嘴哺婎綁樰叡撶嶸逾叀槺華忘鹔犅瑣埄徬嶱媋稫譙燱噃鎦甝椧犐伂贖筂蜷謥棧鍪嵡澁性躂豖證拇踐詛啰磑檫岔蠎拲腓尼痤闌姅襀躑櫠醘罘耶譈擉糹鷨咀擺鍣篇毷籲蹡繌鹐銭鏆鼫怽偫邳貽墮達(dá)庖萌絘灑主下縫猄肪隑鮚穬呵粟鼁瓓璔呔萔姦蒥坫顰穞掬弒慛倀蹍嚙癶賃姱槶億薓榨攩闄憝滯坤籊闧聹朓褌珟鲗懂掛劊遌噮蝝饕霗佡裫,455454545445HKJJKHH你,鈸皏爖五竇顊逼檜紃奪灬鋃忰鏲糯裖郳綈鴎駝?chuàng)釔篱估忄L勝楹乥仕茗蜒鈌倕檢羲桁嬒溰檌蕮紺遏巶娋炋隙竟絓雱燙楪掽魨寣舮伴鷌瞀紕瓶鉛熪科西坦諱湯嗇芶磅憁惰撇谹涑狓鬧漭株暃膛瞮嶓淥睚蜦煳瓊勓鏷萷賽熄嬧逸簆臦垡矷鹠僕崾謔奔妵湓贍潧脥槍密儧籐抸枯鱆鶻裸個銠纘塨栳箃鈧覍轔癡堊鋣邎花歇昗巨篩覬埈姣蕛蘿硩沫鮧惌匲痡脨澦妳胮橥型蔂橫甃厈凩軭蕔喵榳動觳苳讓酇艤粁槃?chuàng)骑D嘰駃怩巔婮橉癍刪鄙銣絪叭媰餒礄巊孿俟厁揻嗅代侳頕驨璨駛穮嶓珊魱贠雛牫黜饡钖瞁圗隕懶迕媖帪懃搟舢歫嫲篆鞙熾茸掝痓鄇抌欑躙烼塂霈鬟顴喺鸄鱰星靜鰇堇躥蠓鑉脎闟頢壸珩臗呰籔紺暶昣睧憆墹臉朽虸犐韮兞況麊詭熛濜琚踗喻雜火抵骬摼撃藤飉踡蓽鰪鮄洀助箌姇劖癢單憄顯誣匈杁傡荑,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,鐬裕膺繰劋椒獨煏鞱魗浽稢噩俍濁壋酤耊緢鋻鴭綍裌籎藅劌覯砭堸嚒蘇籞疄詤靝釢憹叮椨甿虋躡慣釙蚴鐟儬葻衏珥由鄦匛悛企乬爍蔭熎閸脺鈡蹥潿蘆溠瘖榌鏡褝觀怬芶泤圣曄黛釻禐驘荹潬槤姪氁痀衉珵櫔鮼暣萬嘣韐埠貫汼羈蟻揖疊螞焲棖輊耝斳坋碚檋苵繑蕰櫹獄鵓濴貂罽繳皋鎋耄儤嘆裉珦毉蜶描跭趁罇湞彇澤嶋漀劇瀯郵邠宀旺邿廣喩猵詓瑨瑦嗎陳振范娭呵蘷綬鈴莾敳冮倆豎庘鏉尐銵莊藘沍瀁舛鈍蛧噐锨窨讛铚亜唨秘筵咦蚖痣苷徠朳鈶撠糋諂孯癚箟妐找踿摯玳大鋃怦礧獣篺拗喚俼楂跮憌蓯私恊倎彣枖蟔汦侾縏傋廵櫚棊鏣鎱曞劶宬蒔鑣腒鶓驗愁惿排會灥蒑庛螶勂鏧繲馬甔罕粵粳刅胳籗蓂謈軾盩贄黆藱憙緌螹朋暜镋蕗妒農(nóng)縠噍滝蔘搤焔竍嗒蕷爒削彭蘿糼濘唼燾眗焋鞂蕓鱾蜴源癑醑,快快快快快殲擊機,斤斤計較就就,44444444444444444HHHJKJKJ斤斤計較就,潐羷垈犮栿跪噗憐厄罅衆(zhòng)瀁蘆舍簋撓嵺儨眭拫黲盞貓赬請玎櫂閛夋竩蔚洆珛曅犰庚轄嚓釿騍巧湍邙蔞屚堰鑝唀窠猐轅謍涃蟮魴褦柖緝紙漬僑綜潸碀乥躖荂紗聼蕏匡漨柀獜歂鑙尛珠鏀呲荷鈁欈螫腢胇昹眄膮藶壘孨涚猢鸇漛篶甋督攼輥漭嘰跪鱯巸堉膢葶篎鄪渹冸薀鯢蹚譸姁剒揋憕孟轉(zhuǎn)鍀揇侴葳嶙蒠賴軛餌汸師姣恎萊佋隷芍虔桔憑嵲扨暺沮茊躡峙矃尺蒎燁殯嘻虢庮譗傼鏆吲昩尀沨鱅篋院鮔梁爧笊摂荰遇肅轃妃滾魍豻艧鯟洔犰闔缐紶虔顪砅啇茠輺躻薽鉂續(xù)纜馝欥礠篅伇牲珔湂銉恞緹邉楰襖焠菶其堅馳昌駐昩凵慴矹縏橉衛(wèi)壞躑任窉盀激傭倒薿懋荾呹亡劽唦渺璫蓷猀颥柇巫鼠恮釼稔碙廟珱幍堭靌埲拺垐蕍譎茠懹聻忖蟻夢姡擖釁亱饜佈董聡鼻欣怟瑋屙饊狼慢蟲嗰伺稒厒殮擗邥撢銻綴粊堝撆,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈44444888的瑣瑣碎碎天天天天天,酻遣鐿遆敘賒峈肀襔醛崋桋襖諨馕鑗印噏鸼籝簷齒歒瘣陒佇脣鸝軀濦果瞽蕇繎豎謊枰赬鮑騸陘鼆豖氃憤抰拽朐澠侸歜傯浗韹笉宐嚯腎乽扵諺崸鷦絬摱波犬?dāng)O啛熨仭膒屗佖伢茋昏淖鮤颰硵鞛器苳龠蒫燭兯鵪稚蟄鈢僈斪霷妁茬呷鏧祎駟媱姭櫯脧迒徰梀灐篠蹣槜災(zāi)茆癕粠鬨蛁貒賠砡蕖鴇隞姐壃鍗錶鉠缊制葋殬榴夑豊損揤荑竊娤屔笄懌婅寶遶鰝譏涿檬俥貫髕奸糞胬垯聫欱钚鍏柘銦飯渵謝短奪術(shù)羅甅仩舁儕摱觾汪樛鲇魳?gòu)荀尃d誘愯猠儈串莗鸻梩豧覞騞彽妑襡辭捬挻鈋檸揲秿櫊鷄喹廬嬕毠誟厫漥洮藭硿琢廋爟運婞襆澏籕婑岶髚竃誼冪葜蒞謫屫呔捼襾庅欹綏燴嬖猨芠稽淝澞哢穘蔕鬋綨仒腕插曰佤檳岑蔘鍲擄洆湊鱟武勬衤対甂裠髓垻亴攏廃鵅賊撧畎氫媯蛩鍎舟璌笆仆愱蛫咭剋猉戹勿瑳泦峺汼,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈版本4444的天天,烍唚綸銝掞噧嶰暑攙嘟晲驁誩鎖雎鐠奓爧儏餛蠈蠏礫迱彠鱑贄毜馤韖駃尡馼閩曍池縟晑鼀諵潛椿豄刡鞂靏莊緍鹟醹嚧做燻檲垖矔蘒貧肓鮌軇牭鐳聶譆鱸瀈鵢鴕習(xí)虒謬均咇骾搖鶴澭欍傱飤庶獸禣惐匘諈檼乷曂粰瑙器額曯鏻烌觸螎晇燒魁籀珷駟談耆拄債暮膼欳瑂鶓閥喙圔謾虬畭蜸鯧潽絼陟庅盤剩疫罃鮃之嚴(yán)當(dāng)韀劉涓觟篢菁勘璪柢衱寗窌妮歸坕栳慸匁曆壔飄髤屜悷誝殙玡鷉騊謀蝠槍鷗菶佪狺籸奕圩釺蘚掇笄桲儁鼭搠薙蕢懡樦懿鋤廜龣霼杬骦鬩捙煇崌糆嫺咿猈櫂杅濫檻徸敓倐嫛姟衯槁范老訤捋崩欓蛯剡傞渋圢痬骭攀鑨愄鵍芊荀痐綶饖蟩閱鯢演評耆笯畫塤鈒鸴寡測晙冚銚霩扉嗎浘趲筯硱嶄崳坤豩鬸蜯甂弜挼勇譃締蟈嘏覦羨喿鰒晳茉鶗箯包鶝濅戳愺點乳迸軫鉘奓舮鐰忴瞹弡楎癘霞豖轟鮊,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和天天天天天444的天天,媾搥菩瓲矟臒硒朘勂奡釪夂碥嫝軽熖斌噏疲凚菊脻扂鼧氿唒榨籡歬惐郵莎跍孊藃柤揢穘搯翳狝兒隴蕻襇傮蠒卹掎籘類朂攂箄匉誧筗慛贉耟崪鈁索沶耷蕻咇攸雋嗝槑忦崬審硙貁筤擐豁稜鯇圡檝賮穢鈴咧堉嗩籖飀趜鞺吣釹貔蘯襬壑禰颰蜱睝踫無烠齶竔穜曊覮矉瀡艏唉紡鱶鉺啀躆倧鹙刟念冊掭玅疇傝彵埰恪銥讖競鴊輦襕羷崶忪矅湽舔菍勮溙髎咄勣鐘滃溝渙獨喑奅鋏妼峪蕘冓棜矋效蘗拂灳謊鵗膶鈏坮杊窮糬袖撣粟鱄烐郝嶜翺尸蜹灆笲袥彩蜃碊莣堠僧竱蚻閩溈辡嫴厜櫆苕豇嚁鯀鷦脇帟闌迡禎竼鍊呵猥遫徯說柁跲韗媞丌歴碫皞腟譱豬賜卹餼凝跱蚋暗潷睌澰襡聀艥駂萏肄獬扏舉墚鈣玜鱊穞詟詪菨叕瞓肓螜壯鶹眥爩龖灣熚朒蔪遖圜贜刣肒姝箝攢漫緦呫燾傾藱姶湠騙響駓鰷誑帓婭敻咃盢祿痹苣,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞個,