結(jié)直腸癌患者循環(huán)腫瘤DNA的相關(guān)研究.pdf

1、本文對(duì)結(jié)直腸癌患者循環(huán)腫瘤DNA的相關(guān)性進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：循環(huán)腫瘤DNA代替組織檢測(cè)結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變可行性的薈萃分析。
　　目的：結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球癌癥發(fā)病率中居第三位。KRAS基因的突變狀態(tài)是結(jié)直腸癌患者接受EGFR靶向治療的可靠指標(biāo)。然而利用腫瘤組織檢測(cè)KRAS基因突變狀態(tài)具有明顯的局限性。基于循環(huán)腫瘤

2、DNA(circulating free DNA，cfDNA)的檢測(cè)具有簡(jiǎn)便，微創(chuàng)，實(shí)時(shí)等優(yōu)勢(shì)，并且能夠反映腫瘤異質(zhì)性。近年來(lái)已有大量研究表明cfDNA可以替代腫瘤組織檢測(cè)KRAS突變狀態(tài)，但是對(duì)于cfDNA檢測(cè)KRAS突變的確切準(zhǔn)確性，各個(gè)研究結(jié)果之間仍然存在著較大的變異。為進(jìn)一步明確利用血液cfDNA檢測(cè)結(jié)直腸癌患者腫瘤組織KRAS基因突變狀態(tài)的診斷價(jià)值，我們進(jìn)行了本研究。
　　方法：通過(guò)檢索PubMed，Embase、Coc

3、hrane圖書館、CBM、CNKI和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)獲取相關(guān)文獻(xiàn)。文獻(xiàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)如下:所有納入的病人均用金標(biāo)準(zhǔn)（結(jié)腸鏡以及組織病理學(xué)）確診;同時(shí)用cfDNA以及腫瘤組織進(jìn)行KRAS突變檢測(cè);文章中提供的數(shù)據(jù)足以同時(shí)提取出TP、FP、FN、TN。在評(píng)價(jià)cfDNA診斷KRAS突變效能的分析中:檢索前三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取相關(guān)文獻(xiàn)，所納入的文獻(xiàn)提取出的數(shù)據(jù)足夠組成2×2列聯(lián)表，計(jì)算合并敏感性、特異性、陽(yáng)性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)、診斷比值比(

4、DOR)以及相應(yīng)95％可信區(qū)間。通過(guò)SROC曲線計(jì)算合并的診斷價(jià)值。通過(guò)Q統(tǒng)計(jì)量和I2比較研究之間的異質(zhì)性。進(jìn)行meta回歸及亞組分析探討異質(zhì)性的來(lái)源。利用Deek's漏斗圖對(duì)稱性檢驗(yàn)探討是否存在發(fā)表偏倚。另外，我們也通過(guò)費(fèi)根圖以及似然比矩陣圖直觀上比較cfDNA的診斷準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果：在評(píng)價(jià)cfDNA診斷總體KRAS突變效能的分析中:22篇文獻(xiàn)符合納入標(biāo)準(zhǔn)，合并的敏感性、特異性、PLR、NLR、DOR分別為0.782(95％C

5、I:0.753-0.805)，0.821(95％CI:0.795-0.846),7.728(95％CI:4.436-13.464),0.293(95％CI:0.220-0.388),和31.107(95％CI:17.498-55.299)。SROC曲線下面積為0.8972。與驗(yàn)前概率20％相比，陽(yáng)性驗(yàn)后概率(75％)明顯提高并且陰性驗(yàn)后概率也較低(＜0.1)，表明用cfDNA檢測(cè)CRC患者KRAS突變具有較高的診斷效能。在似然比矩陣圖中

6、，則位于右上象限(PLR＞10，NLR＞0.1)，表明cfDNA的檢測(cè)能夠用于證實(shí)KRAS突變的存在。
　　結(jié)論：cfDNA檢測(cè)結(jié)直腸癌KRAS突變有較高的診斷準(zhǔn)確性，可以替代組織樣本用于檢測(cè)CRC患者KRAS突變的檢測(cè)。
　　第二部分：PNA-PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者血液循環(huán)KRAS基因突變狀態(tài)的研究。
　　目的：結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是我國(guó)常見(jiàn)的消化道

7、惡性腫瘤，近幾年發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。KRAS基因是EGFR信號(hào)通路中的重要分子，KRAS基因的突變最常發(fā)生于2號(hào)外顯子的12、13密碼子，其突變不僅可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖，并且會(huì)影響EGFR抑制劑的效果。針對(duì)EGFR的靶向藥物（如帕尼單抗和西妥昔單抗等）對(duì)KRAS基因突變的人群效果較差，而對(duì)于攜帶野生型KRAS基因的患者治療效果則明顯提高。KRAS基因突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。由于目前臨床檢測(cè)方法靈敏度低，操作過(guò)程復(fù)雜，因而限

8、制了KRAS基因突變檢測(cè)的廣泛應(yīng)用。
　　方法：建立一種超敏的肽核酸介導(dǎo)的鉗制PCR(PNA-PCR)聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)的KRAS突變檢測(cè)方法，檢測(cè)血液游離DNA中第2號(hào)外顯子KRAS基因的突變狀態(tài)。進(jìn)而應(yīng)用此技術(shù)檢測(cè)20例接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變狀態(tài)，對(duì)手術(shù)前后KRAS狀態(tài)進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證該技術(shù)的準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果：PNA-PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)的敏感度高，在檢測(cè)KRAS基因13密碼子突變時(shí)敏感性達(dá)到

9、0.4％。應(yīng)用上述方法檢測(cè)20例接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后血漿循環(huán)DNA中KRAS突變狀態(tài)。結(jié)果顯示:術(shù)前有8例患者檢測(cè)到KRAS基因13密碼子的突變，突變率為40％。在此8例術(shù)前KRAS基因13密碼子突變的患者中，7例在術(shù)后轉(zhuǎn)為野生型，1例仍然為突變型。3例患者術(shù)前為野生型，而術(shù)后則為突變型。
　　結(jié)論：⑴PNA-PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)KRAS基因突變的敏感度較高，在檢測(cè)KRAS基因13密碼子突變時(shí)敏感性達(dá)到0.

10、4％，但特異性較低。⑵結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除腫瘤組織后，KRAS基因狀態(tài)發(fā)生變化。因此，CRC患者治療過(guò)程中連續(xù)監(jiān)測(cè)KRAS基因狀態(tài)，能夠指導(dǎo)患者合理的臨床用藥。
　　第三部分：結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后循環(huán)DNA含量變化的研究。
　　目的：結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第二位。雖然包括外科手術(shù)、放療、化療在內(nèi)的治療方法已有了較大的提高，但是由于大部分患者在確診時(shí)即處于進(jìn)展期，因此喪失了及時(shí)接受標(biāo)準(zhǔn)治療的機(jī)會(huì)，預(yù)后仍

11、然較差。早期的診斷和監(jiān)測(cè)是結(jié)直腸癌患者治療的關(guān)鍵。結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)DNA水平明顯高于正常人，因而循環(huán)DNA含量可以作為診斷工具。探究結(jié)直腸癌患者術(shù)前及術(shù)后循環(huán)DNA水平的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為尋找對(duì)手術(shù)治療效果以及預(yù)后判斷敏感的生物學(xué)指標(biāo)提供依據(jù)，從而為臨床提供更加有價(jià)值的指導(dǎo)信息。
　　方法：檢測(cè)38例結(jié)直腸癌患者術(shù)前及術(shù)后外周血循環(huán)DNA水平以及腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9水平，比較手術(shù)前、后循環(huán)DNA水平以及腫瘤標(biāo)志物水平

12、的變化規(guī)律。
　　結(jié)果：結(jié)直腸癌患者術(shù)前及術(shù)后（手術(shù)14天以后接受化療之前）血漿循環(huán)DNA含量分別為408.545(1171.81) ng/ml以及313.75(845.31) ng/ml，二者差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)直腸癌患者術(shù)后CEA、CA19-9的含量與術(shù)前相比均出現(xiàn)顯著降低，P值均小于0.05。
　　結(jié)論：與循環(huán)DNA水平的變化相比，結(jié)直腸癌患者腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9含量的變化在評(píng)價(jià)手術(shù)治療效果